腫瘤中細胞程序性死亡配體1糖基化及泛素化的調控

黎素煥，林幼玉，王清水

福建師范大學生命科學學院，福建福州350117

免疫檢查點通過調控T 細胞在一定范圍內活化，進而阻止過度的免疫反應以及維持機體免疫系統的穩態，因此，免疫檢查點異常是腫瘤發生發展的重要原因[1]。程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）/程序性死亡配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDL1）是腫瘤免疫逃逸的關鍵免疫檢查點之一[2]。T細胞激活可以誘導PD-1 的表達，而PD-L1 在多種腫瘤細胞如乳腺癌、非小細胞肺癌、結直腸癌及黑色素瘤中表達[3-4]。在腫瘤中，PD-L1 是PD-1的主要配體，腫瘤細胞利用自身表達的PD-L1 與活化的T 細胞上的受體PD-1 結合，來增加調節性T 細胞的數量或抑制其活性、下調T 細胞的活性、增強T 細胞的耐受性等途徑[2,4]，實現免疫逃逸。

研究表明，糖基化、泛素化能夠在翻譯后水平調控PD-L1 的表達[5]。表皮生長因子（EGF）對PD-L1 糖基化的調控及細胞周期蛋白D-CDK4 對PD-L1 泛素化的調控均能影響PD-L1 與PD-1 的結合，故EGF 或D-CDK4 與其他抗腫瘤藥物聯用時，可以顯著提高T 細胞的抗腫瘤活性[6-7]。因此，調控PD-L1 的糖基化或泛素化可能是腫瘤免疫治療的潛在手段。在此，我們簡要綜述腫瘤中PD-L1 的糖基化及泛素化修飾的調控研究進展。

1 PD-1/PD-L1

PD-1 是由288 個氨基酸殘基組成的Ⅰ型跨膜蛋白，胞外部分含有一個免疫球蛋白超家族結構域，胞質部分含有一個免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM）和一個免疫受體酪氨酸開關基序（ITSM）[4]，這2 個基序中的酪氨酸能夠被磷酸化Src 同源磷酸酶1（SHP-1）和2（SHP-2）結合并磷酸化。PD-1 最先是在凋亡的T 細胞淋巴瘤中被發現的，能夠介導細胞的凋亡，主要表達于活化的T 細胞、B 細胞、自然殺傷細胞等[8-9]。PD-1 對于細胞耐受性的維持和免疫系統T 細胞的調節具有重要意義[10]。PD-L1 和PD-L2 是PD-1 的2 個配體，但在腫瘤細胞中PD-1 主要的配體是PD-L1。

PD-L1 是由290 個氨基酸殘基組成的Ⅰ型跨膜蛋白，含有跨膜結構域、Ig-V 和Ig-C 樣細胞外結構域，以及可能不包括信號基序但在不同物種中高度保守的短細胞質結構域[11-12]。通常，PD-L1在腫瘤細胞中的表達水平高于正常體細胞[13]。最新研究發現，腫瘤細胞表達的PD-L1 不僅存在于細胞內及定位于細胞膜上，還可以以不同的形式被分泌并游離在腫瘤細胞外[14-15]。體外對腫瘤細胞進行PD-L1 轉基因表達，腫瘤細胞利用PD-L1與T 細胞的PD-1 結合抑制免疫反應，使得細胞毒性T 細胞不能有效殺傷腫瘤細胞，并促進腫瘤在小鼠體內的發生和侵襲正常組織的能力[16-18]。這提示了PD-L1 是腫瘤免疫逃逸的重要免疫抑制因子。

腫瘤微環境中PD-L1 和PD-1 的表達水平比正常組織中高。當PD-L1 和PD-1 的細胞外結構域相互結合，即會誘導T 細胞募集SHP-1 和SHP-2 對PD-1 細胞內ITIM 和ITSM 基序中的酪氨酸進行磷酸化，隨后抑制TCR 信號的傳導途徑，減少T細胞的活化[19-20]。PD-L1 和PD-1 結合也會通過抑制CD8+和Treg 等T 細胞的分化及激活，誘導T 細胞凋亡、細胞因子產生和細胞溶解活性，并進一步抑制抗腫瘤免疫[12,17,21]。

2 腫瘤細胞中PD-L1 糖基化的調控

2.1 糖基化

糖基化是發生在哺乳動物中的一種重要的翻譯后修飾，膜蛋白和分泌蛋白質幾乎都需要經過糖基化修飾[22]。糖基化對蛋白質的折疊、定位、細胞內轉運和免疫原性具有重要的作用[17,23]。糖基化主要發生在內質網和高爾基體中，需要復雜的酶、細胞器以及成功產生碳水化合物相關翻譯后修飾所需的其他因子的協同作用[22]。N-糖基化和O-糖基化是哺乳動物細胞中最常見的糖基化修飾類型[24]。

糖基化異常是惡性腫瘤細胞的一個普遍特征。與正常組織相比，腫瘤細胞通常顯示出異常的糖基化修飾。糖基化異常與腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移以及免疫逃逸等關系密切[25]。黏蛋白、CD147、骨橋蛋白、α2-巨球蛋白和CD44 等蛋白質的異常糖基化修飾也被證實有助于腫瘤細胞的黏附、遷移、侵襲、增殖或免疫逃逸[24,26-29]。

2.2 PD-L1 糖基化的調控

N-糖基化在確定蛋白質結構和功能中起著關鍵作用。N-糖基化是膜上蛋白質-蛋白質相互作用的重要翻譯后修飾，例如配體和受體之間的相互作用。N-糖基化是PD-L1 糖基化修飾的主要形式，且PD-L1 糖基化對維持其本身的穩定性至關重要[6,17]。目前，發現并確定的N-糖基化位點有N35、N192、N200 和N219，而且在這4 個位點上僅僅發生N-糖基化，其中N192、N200 和N219的N-糖基化有助于PD-L1 的穩定[6]。

腫瘤細胞中PD-L1 糖基化修飾有多種調控機制。N-糖基轉移酶STT3 有2 種亞型，即STT3A和STT3B，二者協同維持腫瘤細胞PD-L1 糖基化的穩定[30]。上皮-間質轉化（EMT）通過β連環蛋白轉錄誘導N-糖基轉移酶STT3，并且隨后STT3依賴的PD-L1 N-糖基化維持穩定并上調PD-L1的表達，依托泊苷可逆轉這種情況[30]。Li 等描述了糖原合成酶激酶3β（GSK3β）通過b-TrCP 誘導PD-L1 的磷酸化依賴性蛋白酶體降解，而這種相互作用被N192、N200 和N219 處的PD-L1 糖基化拮抗，因此，在乳腺癌中，EGF 誘導GSK3β的失活可誘導PD-L1 的糖基化增加，以此維持PD-L1 的穩定表達[6]。β-1，3-N-乙酰葡糖胺基轉移酶3（B3GNT3）是在高爾基體中表達的Ⅱ型跨膜蛋白，可在聚-N-乙酰基乳糖胺鏈的生物合成過程中發揮作用，并且具有調節T 細胞歸巢、L-選擇素配體功能和淋巴細胞運輸的功能[31]。Li 等的研究表明，由于PD-L1 的N192 和N200 上的聚糖結構都含有聚-N-乙酰基乳糖胺，EGF 可通過上調B3GNT3 來增強PD-L1 糖基化[32]。另外，2-脫氧葡萄糖被證明可以作為葡萄糖類似物來降低PD-L1糖基化[33]。Cha 等也在體內外的研究中發現，PDL1 S195 磷酸化與PD-L1 4NQ 的情況一致，即S195 磷酸化后PD-L1 不能正常進行糖基化修飾，此時PD-L1 的穩定性下降[17]。

在腫瘤中，糖基化修飾不僅影響PD-L1 的穩定，而且影響PD-L1 的功能和腫瘤免疫。Li 等對PD-L1 的4 個N-糖基化位點N35、N192、N200 和N219 進行突變以及使用N-糖基化抑制劑處理野生型PD-L1，發現PD-L1 N-糖基化的改變顯著降低了PD-L1 和PD-1 的結合，使T 細胞活化增加以增強抗腫瘤免疫反應，提示腫瘤免疫中的PD-1與PD-L1 相互作用需要PD-L1 的糖基化[32]。腫瘤細胞經二甲雙胍處理后，PD-L1 糖基化不能正常進行，直接導致PD-1 與PD-L1 的結合顯著減少，且腫瘤微環境中的細胞毒性T 細胞群體數量及活化提高，體內腫瘤的生長也被抑制[17]。2-脫氧葡萄糖及抑制EGF 降低PD-L1 的穩定性，均能破壞PD-L1 與PD-1 之間的相互作用，使腫瘤細胞對T細胞介導的細胞毒性重新恢復敏感，增強了T 細胞對腫瘤細胞的有效殺傷[32,33]。

3 腫瘤細胞中PD-L1 泛素化的調控

3.1 泛素化

泛素化調節多種復雜的細胞過程，包括蛋白質降解、蛋白質-蛋白質相互作用、受體內吞和DNA 損傷修復，是真核生物中常見的蛋白翻譯后修飾[34,35]。泛素化即是在泛素激活酶E1、泛素結合酶E2 及泛素連接酶E3 等一系列酶的參與下，將泛素添加到靶蛋白上[36]。細胞中不需要的或受損的蛋白質在被蛋白酶體識別并降解之前，需要被泛素化。泛素化與乙酰化和磷酸化一樣，都是可逆反應，其逆向反應為去泛素化。

在癌癥中，泛素化可能導致致癌途徑的激活或失活。E3 連接酶和去泛素化酶可調節促癌或抑癌蛋白的活性或降解，如核因子κB（NF-κB）、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1B（p27）和抑癌基因p53 的異常表達與癌癥相關[37]。靶向泛素化E3 連接酶的抗腫瘤藥物IMiDs 已獲得了美國FDA的批準并應用于臨床[38]。去泛素化酶的抑制劑WP1130、P5091 和B-AP15 已被證明可分別增強抗腫瘤活性、抑制腫瘤細胞的增殖以及誘導腫瘤細胞凋亡[39]。

3.2 PD-L1 的泛素化調控

PD-L1 的泛素化位點尚不清楚，但UbPred 預測軟件指出PD-L1 中的2 個賴氨酸殘基（K178，K281）很大可能是潛在的泛素化位點[5]。內質網相關蛋白降解的E3 連接酶HRD1 也可作為腫瘤細胞中PD-L1 泛素化的E3 連接酶[17]。目前對于PD-L1 泛素化的位點及參與泛素化過程的特異性酶的了解比較少，人們的關注點主要集中在腫瘤細胞中PD-L1 泛素化的調控機制。

細胞周期蛋白D-CDK4 是一種翻譯后調控的負調控因子，可以影響PD-L1 的泛素化。DCDK4 通過誘導滯蛋白3（cullin 3）-SPOP 介導的PD-L1 泛素化來負調控PD-L1 的表達，并且CDK4/6 的抑制提高了PD-L1 表達水平，這一泛素化調控與抗PD-1/PD-L1 療法協同可增強腫瘤免疫[7,40]。此外，COP9 信號復合體5（CSN5）作為一種致癌蛋白，具備去泛素化的活性，也是一種PD-L1 泛素化的負調控因子[41-43]。CSN5 的表達受腫瘤壞死因子α（TNF-α）的誘導，使PD-L1 去泛素化以穩定PD-L1，CSN5 抑制劑姜黃素可逆轉這種情況，并提高CTLA4 阻斷療法的治療效果[43]。CKLF 樣MARVEL 跨膜結構域蛋白6（CMTM6）是一種普遍表達的蛋白質，可調控跨膜蛋白和分泌蛋白的轉運。CMTM6 可結合PD-L1，并有助于PD-L1 在細胞周期中減少泛素化和溶酶體降解，誘導并穩定PD-L1 在細胞膜上的表達，增強表達PD-L1 的腫瘤細胞抑制T 細胞的能力[44]。

PD-L1 的糖基化異常，亦能使PD-L1 的泛素化增加。Li 等將PD-L1 的4 個糖基化位點N35、N192、N200 和N219 同時突變或使用衣霉素處理，使PD-L1 處于非糖基化狀態，在蛋白酶體抑制劑MG132 存在下檢測到非糖基化PD-L1 的泛素化明顯增加[6]。此外，還發現在腫瘤細胞中，GSK3β可以通過β-TrCP 介導PD-L1 泛素化而使其被蛋白酶體降解，EGF 可以使GSK3β失活增加PD-L1的糖基化來減少PD-L1 的泛素化[6]。隨后，Horita等也再次證明EGF 確實具有抑制PD-L1 的泛素化的作用[5]。二甲雙胍誘導PD-L1 磷酸化，導致PD-L1 糖基化異常而使PD-L1 泛素化增加，進而誘導蛋白酶體降解，并在腫瘤微環境中增加CD8+T 細胞的活化及對腫瘤細胞的殺傷，協同CTLA4 抗體顯著抑制腫瘤的生長[17]。

4 結語

腫瘤中的糖基化和泛素化異常影響腫瘤細胞的功能性，如增殖、侵襲、凋亡及腫瘤免疫等，調控腫瘤相關蛋白的糖基化或泛素化很大可能會影響腫瘤的發展或刺激免疫系統對腫瘤進行攻擊，是潛在的治療腫瘤的方法。此外，糖基化和泛素化被證明能通過影響腫瘤細胞的PD-L1的穩定和功能性而影響PD-L1 與T 細胞的PD-1的結合，從而進一步影響腫瘤微環境中T 細胞對腫瘤細胞的殺傷。目前，在臨床上已有5 種抗體針對PD-1/PD-L1 這一免疫靶點治療癌癥，但抗體治療并不能在每個腫瘤患者中都取得很好的療效。因此，通過調控PD-L1 的糖基化和泛素化，進而破壞PD-L1 與PD-1 之間的相互作用，同時協同臨床上的抗腫瘤治療藥物對腫瘤患者進行免疫治療，可能是潛在的免疫治療手段。