嗜黏蛋白阿克曼菌
——一種潛在的益生菌

賓蕾，鄧仲良，畢玉晶，楊瑞馥

1.軍事科學院軍事醫學研究院微生物流行病研究所，北京100071；2.南華大學公共衛生學院，湖南衡陽417000

腸道微生物群是指定植在人體消化道內的微生物，它的數量多、種類復雜，由細菌、真菌、病毒和原生生物構成。由于其中的細菌研究最為廣泛，因此，腸道微生物群又習慣地被稱為腸道菌群。正常成人的腸道菌群總重量為1～2 kg，數量至少達1014個，是人體細胞的1～10 倍，包含的基因數量是人類基因數量的150 倍[1]。眾所周知，腸道菌群不僅協助宿主消化食物及提供營養成分，還對宿主的健康有著深遠的影響。正常腸道菌群對宿主很多重要生理功能的維護和發揮起著非常重要的作用，一旦腸道菌群的正常穩態遭到破壞，即生態失調，就會引發多種疾病。許多研究表明，腸道菌群在我們的生長、發育、代謝等各個方面都發揮著重要作用[2-6]。因此，可以通過調節腸道菌群的結構來實現改善人體健康狀態的目標。

近年來發現許多疾病的發生與腸道菌群紊亂有著密不可分的關系，例如，腸道炎癥、肥胖、糖尿病等代謝綜合征往往伴隨著腸道菌群生態失調[7]，研究表明腸道微生物在宿主代謝和低度炎癥的調節中起重要作用[8-10]。以腸道原籍菌為基礎研發而成的益生菌有望成為許多疾病的治療新方式。但目前市場上銷售的大多數益生菌主要包括乳桿菌和雙歧桿菌[11]，它們分別來自厚壁菌門和放線菌門，是至今研發最為成熟的腸道益生菌。除此之外，研究發現在已鑒定的下一代有益微生物中，人類腸道菌群中的嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila，AKK）是一種非常有前景的候選細菌[12]。AKK 是從人體糞便中分離培養的一株嚴格厭氧的腸道菌，與機體能量代謝、免疫應答以及腸道黏蛋白的分泌密切相關，其代謝特性以及影響宿主健康的調控機制是近年來的一大研究熱點。

1 嗜黏蛋白阿克曼菌

AKK 的研究歷史并不長，它于2004 年被荷蘭瓦赫寧根大學微生物實驗室的科研工作者通過厭氧培養從人體糞便中分離、鑒定并命名，是一種革蘭陰性嚴格厭氧的腸道細菌[13]。

AKK 隸屬疣微菌門（Verrucomicrobia），阿克曼菌科（Akkermansiaceae），阿克曼菌屬（Akkermansia）。這個屬是該科的惟一成員，是疣微菌門中的優勢菌群，約占83%。阿克曼菌屬也是在人腸道中發現疣微菌門中的惟一屬。與該屬16S rRNA 基因高度相關的序列廣泛存在于脊椎動物（如人、兔、小鼠和蟒蛇等）的腸道內。對人糞便或活組織樣品測序發現，有8 條16S rRNA 基因序列與阿克曼菌屬序列相似性水平≥98%，有3 條序列與AKK 的16S rRNA 基因序列相似性＜98%，提示它們可能代表阿克曼菌屬的其他種，稱為AKK 樣菌[14]。但目前阿克曼菌屬僅有從人糞便分離的AKK 和從網狀蟒蛇糞便中分離的嗜多糖阿克曼菌（A.glycaniphila）2 種[15]，且AKK 是疣微菌門中第一個被成功分離和鑒定的腸道菌種[16]。

2 AKK 在人體中的定植情況

2.1 AKK 主要定植部位

AKK 樣菌存在于母乳中和消化道的不同解剖部位如口腔、胰腺、膽系統、小腸、闌尾和大腸中[17]。此外，在敗血癥和肝硬化患者血液中也檢測到AKK 樣菌的序列，并從敗血癥患者血液中分離得到了AKK[18-20]。但定植在這些部位的AKK，其功能可能與定植在結腸黏液層的AKK 不同。整個消化道都存在AKK 樣菌，表明該菌可能具有更多的功能尚未發現。在此，我們主要關注AKK定植最為豐富的腸道部位。

腸上皮細胞覆蓋著黏液層，該黏液層一方面能吸收營養物質，為微生物提供生長能源；另一方面還可保護腸上皮細胞抵御有毒物質和病原菌的侵襲，是機體重要的保護屏障[21-25]。黏液層中黏液的主要成分為黏蛋白，AKK 有著降解黏蛋白的特性，因此它主要定植在黏液層，豐度通常占腸道微生物群的1%～3%。

2.2 AKK 在健康人群的定植差異

AKK 存在于人體腸道中，人類整個生命的不同階段都有AKK[26-27]。2007 年，Collado 等根據AKK 的16S rRNA 基因序列可變區設計了特異性引物AM1 和AM2，并驗證了該引物對在60℃復性時是AKK 特異的，擴增產物大小為327 bp。研究人員通過16S rRNA 熒光原位雜交（FISH）和實時定量PCR（qPCR）對歐洲不同年齡段的健康受試者糞便樣本進行分析，證明AKK 廣泛存在于人腸道中，平均定植率約為74.70%。在兒童早期AKK就在腸道內定植（檢測到糞便中AKK 濃度為102～104CFU/g），并在一年內就接近健康成人（AKK 濃度為105～108CFU/g）水平，而老年受試者糞便中的AKK 含量比成人低[26]。在芬蘭、德國和馬拉維等國家[28-30]，嬰兒腸道中存在AKK 或疣微菌門細菌。因此，嬰兒腸道中AKK 的存在被認為是腸道微生物群發育和多樣性的標志。但上述研究結果并不完全適用于不同國家的人群，如中國南方人群中AKK 定植率約為51.74%，遠低于歐洲人群，而老年人糞便中AKK 數量卻比年輕人高[31]。此外，Kong 等通過對16S rRNA 基因V4-V5 區測序，研究168 位來自中國四川都江堰和雅安的人（67 位長壽老人，54 位老年人，47 位年輕人）的糞便菌群，發現長壽老人菌群的多樣性更高，健康的衰老狀態與腸道菌群有關，尤其是在長壽老人糞便中梭菌屬XIVa、瘤胃菌科、AKK 及Christensenellaceae 科的相對豐度均較高[32]；另一項研究也發現百歲老人或人瑞（年齡為105 歲以上）的糞便中AKK 具有更高的濃度，因此，該細菌被認為在長壽人群的免疫和代謝健康中發揮重要作用，也可能成為健康衰老的生物標志物之一[33-34]。考慮到地域不同、人群居住環境和飲食結構差異對菌群定植的影響，還需要進一步對年齡與AKK的相關性進行分析。

2.3 AKK 的定植與疾病的關系

許多研究表明AKK 的存在與人體健康相關。多數疾病狀態下，AKK 的豐度明顯低于健康人群，呈負相關。例如，與健康人群相比，AKK 在炎癥性腸病（IBD）患者中的豐度降低[35-36]；急性闌尾炎患者體內AKK 數量減少，且其豐度與闌尾炎的嚴重程度成反比[37]。此外，AKK 的豐度也與盲腸炎、青少年自閉癥[35,38]等疾病呈負相關性。

目前關于AKK 與代謝疾病關系的研究頗多。肥胖兒童中AKK 數量顯著減少[39]，且有研究證實通過AKK 的定植可以減少體內脂肪堆積，有利于降低體重[40]。因此，AKK 可作為潛在的肥胖判定指標。此外，在糖尿病前期和Ⅱ型糖尿病期間，疣微菌綱的豐度顯著降低[41]。AKK 與Ⅱ型糖尿病的幾項生化指標也顯示出負相關[42]。最近，H?nninen 等發現[43]，在發病率較高的Ⅰ型糖尿病小鼠模型中，腸道菌群中缺少AKK。這與其他研究是一致的，即在人體及小鼠中，腸道菌群中AKK 的豐度與Ⅰ型糖尿病呈負相關，提示AKK 在Ⅰ型糖尿病中起保護作用。研究者提出AKK 的保護機制可能是促進黏液產生以使黏液層增厚，通過促進Foxp3+Treg 細胞、IL-10、TGF-β的增加以減少胰島炎癥[43-44]。早期研究證明通過給小鼠灌胃AKK 可以防止肥胖和相關并發癥的發生[40,45]。高脂飲食小鼠中AKK 在體內定植是降低的，而在飲食中添加AKK 可使體重、空腹血糖、胰島素抵抗及內毒血癥恢復正常。值得注意的是這些疾病常伴有腸道功能紊亂和腸道屏障完整性受損，因此，腸道黏液減少進而導致AKK 的定植減少；而腸道通透性增加導致腸道的內毒素進入機體，血漿脂多糖水平升高或細菌移位，從而引起炎癥和代謝紊亂等病理狀況。因此，后續研究須進一步考慮微生物群與黏液層完整性的關系。

酒精性肝炎（ASH）患者糞便中的AKK 豐度同樣低于健康人，間接表明AKK 與肝臟疾病的嚴重程度相關。同樣地，通過酒精灌胃野生型小鼠可顯著降低AKK 的豐度，而口服AKK 可恢復酒精導致該菌的減少。研究表明，AKK 可預防性減少肝損傷、脂肪肝和中性粒細胞浸潤，防止酒精誘導的腸漏，增加腸道黏液層厚度和緊密連接蛋白的表達，還可治療性改善酒精性肝病（ALD）患者的肝損傷和中性粒細胞浸潤[46]。

2017 年Science發表的一篇關于AKK 的報道使其受到更多的關注，來自法國Gustave Roussy癌癥研究所的Zitvogel 教授帶領她的團隊給出了非常轟動的結果：AKK 在增加癌癥免疫治療效果方面有非常顯著的作用。研究人員對249 名接受免疫抑制劑治療的癌癥患者進行觀察，其中69 名在使用免疫抑制劑的同時還接受了廣譜抗生素治療。經觀察發現，在接受抗生素治療的患者群體中，癌癥復發概率更高，并且接受治療后存活時間短，平均總生存期為11.5 個月，遠遠低于未接受抗生素治療患者的20.6 個月。而在研究過程中，發現免疫治療效果好的患者體內，其腸道菌群更豐富，尤其是AKK 的存在使患者免疫治療效果更好。為驗證這種相關性，研究人員將具有良好免疫治療效果患者的糞便移植到無菌小鼠體內，發現免疫效果高于那些未經移植的小鼠；對無免疫反應的無菌小鼠給予口服AKK，再用免疫抑制劑來治療，發現免疫得到恢復，小鼠體內的腫瘤幾乎完全消失[47-48]。這一研究首次證明了AKK 在免疫反應中的作用，說明腸道微生物在免疫治療中同樣發揮重要作用。

上述研究均表明AKK 與健康狀態密切相關，AKK 可能作為某些疾病的生物標志物，也可能成為一種極具前景的益生菌，尤其是在糖尿病、肥胖、代謝紊亂等相關疾病的預防和治療方面具有極大的潛力，對未來研究和開發具有重要意義。

3 AKK 的生物學特性及其在宿主中的代謝

AKK 最初由Derrien 等描述[13]，是一種橢圓形、非運動型、不產芽孢的厭氧革蘭陰性細菌，可單獨或成對生長，在含有黏蛋白的培養基中還可抱團生長。該細菌在黏蛋白培養基上生長時，在透射電鏡下可見存在由莢膜聚合物構成的絲狀結構。AKK 基因組中存在許多編碼黏蛋白降解酶的基因，共78 個基因（占總基因的14%）被注釋為可參與黏液降解，編碼糖苷酶、唾液酸苷酶、蛋白酶和硫酸酯酶等[14,49-50]。而AKK 降解黏蛋白這一特性恰恰決定了它定植于黏蛋白豐富的腸道黏液層中的偏好。

腸黏液是由杯狀細胞合成并分泌的，覆蓋腸細胞，形成松散而堅固的黏液層，分為2 層：一層是沒有細菌的內黏液層，一層是較厚的含有共生細菌的多層外黏液層[51-52]。黏液的主要成分為黏蛋白，黏蛋白是AKK 的營養源，它由大量O-連接聚糖修飾的肽骨架組成，肽骨架富含蘇氨酸、絲氨酸、半胱氨酸和脯氨酸，聚糖由多糖或糖基團，含有甘露糖、半乳糖、巖藻糖和N-乙酰基己糖胺，如N-乙酰-葡萄糖胺（Glc-NAc）或N-乙酰-半乳糖胺（Gal-NAc）[53]。AKK 存在于該黏液層中并代謝黏液，同時產生乙酸鹽和丙酸鹽，由黏蛋白酶釋放的糖也促進其他細菌產生丁酸鹽[54]。

像許多厭氧菌一樣，AKK 被描述為產生短鏈脂肪酸（SCFAs）的發酵細菌。AKK 能夠發酵的糖類包括半乳糖、巖藻糖、葡萄糖、Glc-NAc 和Gal-NAc，但這些糖僅在黏蛋白或大量胰蛋白酶消化物或酪蛋白存在下才有可能降解[55]。由于黏液降解，AKK 產生寡糖和SCFAs，這些產物可以刺激微生物群的相互作用和宿主反應。寡糖和乙酸鹽可以刺激靠近黏液層定植細菌的生長和代謝活動，同時抵抗那些必須穿過黏液層才能到達腸細胞的致病菌。由AKK 產生的丙酸鹽可以通過短鏈脂肪酸受體43（Gpr43）作用于腸道組織，而其他SCFAs 也可以通過Gpr41 向宿主發出信號[56-57]，從而觸發宿主表達機制的級聯反應，并與其他信號通路一起，在僅有AKK 定植的無菌小鼠中產生免疫刺激和代謝信號達到免疫調節作用[58]。

最近的研究表明，盡管AKK 用黏蛋白作為營養源，但其與人類和動物的黏液厚度和腸屏障完整性呈正相關[26,40,59-60]，例如，AKK 的補充增加了小鼠產生黏液杯狀細胞的數量[61]。AKK 促進黏液厚度的機制尚未完全清楚，很可能是一方面降解黏液蛋白生成許多短鏈脂肪酸，而短鏈脂肪酸是宿主上皮細胞合成和分泌黏液蛋白較好的能量來源；另一方面，黏液蛋白的降解可刺激杯狀細胞產生更多新的黏蛋白，以降低宿主蛋白的沉積，而新生黏蛋白又刺激AKK 的生長，二者形成正反饋回路，這種良性循環使腸道黏液層不斷更新，對腸上皮細胞也可起到良好的保護作用。

4 AKK 的分離培養

4.1 AKK 分離的概況

最近，研究人員從網狀蟒蛇糞便中分離出與AKK 基因序列有95%相似度的細菌，命名為嗜多糖阿克曼菌[13,15]。2016 年，我國學者從172 份中國南方成人糞便樣本中分離得到22 株AKK，并將它們分為12 個基因型，不同受試者體內的基因型別不同，其中3 個受試者中呈現多種基因型[31]。隨后，該團隊測序分析了來自人和小鼠糞便的39 株AKK，共鑒定出5644 個獨特蛋白，遺傳發育分析可將它們分為3 個譜系類群，分別表現出不同的代謝及功能特征[62]。

從人糞便中首次分離AKK 已有10 余年，在最初的5 年里，每年僅有1 篇關于AKK 的報道。自2010 年后AKK 逐漸受到關注，關于它與人體健康和疾病間關系的研究開始明顯增多，但其分離培養方法的優化還處于停滯狀態，如何快速分離和分型一直是研究瓶頸。現階段的研究重點應關注從更多不同宿主體內分離大量AKK 菌株，并分析其基因和生理功能差異，尋找其中的特異菌株，為后續探索其與人體健康關系的研究提供新的支撐。因此，需要加大AKK 分離培養規模，并應著眼于AKK 培養條件的優化，為建立快速、準確的分離、純化和鑒定技術奠定基礎。

4.2 分離AKK 的樣本選擇

如何順利準確地從人體中分離出AKK，樣本的選擇尤其重要，需要先確保所選對象中含有豐富的AKK，才能為后續分離培養實驗的開展提供保障。在小鼠模型中，Derrien 等將AKK 定植于無菌小鼠體內，由于大部分的黏蛋白都在盲腸中產生[58]，因此該菌在盲腸中的定植數量最高。在倉鼠禁食實驗中，發現禁食后的倉鼠體內AKK 豐度顯著升高[63]。還有使用萬古霉素處理糖尿病小鼠模型，發現該抗生素的處理可使小鼠體內疣微菌門的相對豐度由10%左右升高至87%[64]。用二甲雙胍（常用的治療Ⅱ型糖尿病藥物）處理小鼠后，其體內的AKK 豐度也顯著升高[61]。此外，增加AKK 豐度的方法還包括攝入雙歧桿菌、低聚果糖、短鏈碳水化合物（FODMAP）、大黃提取物或特定抗生素等[65]。因此，欲從不同物種體內分離出AKK，可考慮使用上述刺激條件以提高動物體內AKK 豐度，利于順利分離得到該細菌。

上述所提到的提高體內AKK 豐度的方式皆基于動物模型，為分離該菌對人群實施干預是不可行的。但AKK 在人體的定植狀態較為穩定，在健康人群腸道中其豐度通常占1%～3%，而在腸炎病患者、超重肥胖人群及Ⅱ型糖尿病患者體內AKK 的數量和豐度均較正常人低[39]。但通過膳食控制或服用益生元，可改善健康狀況使得AKK 豐度得到恢復甚至升高，同時避免高脂飲食和大量飲酒導致的腸道內AKK 豐度的降低[40,66-67]。合理飲食、健康作息、適當運動對維持人腸道內較高AKK 豐度是有幫助的。故在選擇研究對象時要綜合考慮上述因素，選擇合適人群收集糞便作為樣本，更有利于實驗的順利開展。

4.3 AKK 培養條件的選擇及改進

AKK 在20～40℃和pH5.5～8.0 時都能夠生長，最佳溫度為37℃，最佳pH 值為6.5，孵育時間為3～7 d[13]。AKK 在最初的文獻報道中被描述為嚴格厭氧生長，所需生長條件為：182 kPa、80%N2、20% CO2[13]；或90% N2、10% CO2[68]；或85% N2、10% CO2、5% H2[69]；或100% N（2ATCC 推薦）。在這些條件下均能順利培養出AKK，并達到實驗所需的菌濃度。但近期研究發現，與人類腸道微生物群的許多其他成員相比，AKK 是一種耐氧厭氧菌而不是嚴格的厭氧菌。實驗數據表明[70]，AKK在厭氧和有氧環境下的生長無差別，將其放置在大氣常氧水平條件下1 h，80%的AKK 仍保持細胞活性，表明該細菌能夠在環境空氣中存活，也說明該細菌不是對氧高度敏感的嚴格厭氧菌，而是具備一定的耐氧能力。

自首次成功分離AKK 后，用于其分離的培養基——黏蛋白基礎培養基一直沿用至今。AKK可利用胃腸道黏蛋白作為惟一的碳源和氮源進行生長，黏蛋白培養基也是目前惟一的選擇性培養基。2016 年，我國研究者用該黏蛋白基礎培養基進行選擇增菌，并在篩選過程中進行改進，挑取在平板上生長的單克隆接種至添加了萬古霉素的還原性巧克力培養基中進行純化，最終順利分離得到AKK。在培養基中添加適量的萬古霉素（5 μg/mL），可在抑制革蘭陽性菌生長的同時刺激AKK 生長，更利于該細菌的分離篩選。但黏蛋白基礎培養基的配制過程十分復雜，須添加多種微量元素，在日常實驗工作中培養基的配制極其耗時。之后的許多研究中，發現在腦心浸液肉湯（BHI）或哥倫比亞肉湯（CBA）培養基中添加一定的黏蛋白來培養AKK，均能滿足其生長的營養要求[15,59,61,71-73]。

目前，已知的適合培養AKK 的培養基均含有動物成分，而來源于動物的營養成分可能含有病毒、朊病毒、過敏原或細菌污染物，今后若將AKK的培養物用于人類食品或藥品會受到質疑。2016 年，Belzer 等對培養AKK 的培養基進行了改造，并申請了專利[74]。他們用16 g/L 大豆蛋白胨加上25 mmol/L 混合糖（葡萄糖和N-乙酰葡萄糖胺）代替動物源的黏蛋白，觀察到AKK 生長良好。此外，還發現通過添加一定量的蘇氨酸或酵母提取物等也可刺激其生長。在該化學限定培養基上可獲得高產量，有利于AKK 的大規模生產，滿足了在食品、飼料或藥物等方面的應用。同年，Plovier 等[75]在實驗中重復了該培養基的使用方案，結果發現能夠達到與傳統黏蛋白基礎培養基相近的培養效果。2017 年，我國學者改良了黏蛋白基礎培養基的營養條件[76]，通過添加篩選到的生長刺激因子來提高AKK 的生長速度和菌液濃度。研究發現，AKK 在添加了低聚木糖、低聚半乳糖、環糊精和索萊寶蛋白酶酶解雞蛋清這4 種生長刺激因子的培養基中生長速度快。其中10 g/L 索萊寶蛋白酶酶解雞蛋清、5 g/L 環糊精、5 g/L 低聚半乳糖的組合物對細菌的生長促進效果最好，可使AKK 的生長時間由原來的5～6 d 縮短為24～36 h，且菌液D600nm值也由0.0697 升至0.7197，極大地促進了AKK 的生長。

5 結語

下一代益生菌產品包括擬桿菌屬、梭菌屬、阿克曼菌、糞桿菌屬等[77]，其中AKK 作為一種潛在的腸道益生菌已成為研究熱點。AKK 可以降低肥胖、糖尿病患者的炎癥反應，改善腸道的屏障功能，還可以調節機體的免疫應答，維持體內代謝平衡，在癌癥免疫治療中也發揮著顯著增效作用。這些都表明AKK 在腸道中的定植狀態與宿主的健康息息相關。基于AKK 如此強大的益生作用，需要對其深入研究，為后續益生菌微生態制劑的研發提供科學依據。而這些研究與開發，都離不開AKK 菌株的培養與篩選。

作為腸道潛在的益生菌，AKK 也可能具有潛在致病性，其安全性有待研究。下一代益生菌產品是“雙刃劍”，所以對菌株的安全性評價是首要問題，與傳統益生菌產品（乳酸菌、雙歧桿菌）相比，下一代益生菌產品在使用上須嚴格限定適用人群，實現精準施用。同時，還應重視下一代益生菌菌株抗生素耐藥性基因在食物鏈中播散的評估，保證菌株對抗生素的藥物敏感性。而針對AKK，目前研究者還聚焦在早期的安全性研究和菌株適宜性研究[78]。雖然阿克曼屬是宿主腸道中廣泛定植菌屬，目前還沒有表現出任何致病性[79]，但AKK 在不同物種體內定植表達和功能調控具有一定的差異，發揮的作用也不盡相同。同一種益生菌的不同菌株之間對宿主健康的影響也是存在差異的[80]，因此，為研究菌株和疾病間的因果關系，研究者不能只把培養目標定在種水平上，而應盡可能地建立菌株水平的菌種庫以供篩選和鑒定，同時研究其分子作用機制，為人類健康助力。