DNA分子標記技術在DUS測試中的應用探討

韓瑞璽 張 晗 趙艷杰 馬瑩雪 李汝玉 唐 浩

（農業農村部科技發展中心，北京100125）

特異性（Distinctness）、一致性（Uniformity）和穩定性（Stability）測試（簡稱DUS測試）以形態標記為基礎，實現對品種的描述、三性判定和定義品種，是國際植物新品種保護聯盟（UPOV）確定的授予品種權的依據。DNA分子標記技術鑒定，又稱DNA指紋鑒定，是以一組遺傳標記的基因型為基礎，實現對品種的遺傳多樣性分析以及指紋信息的檢測。旨在探討DNA分子標記技術在DUS測試中應用的“是”與“非”，提出優化DNA分子標記技術應用的建議，以期在保證科學性的基礎上提高DUS測試效率，服務現代種業管理。

1 傳統特異性測試中面臨的現實困難

DUS測試是品種權授權的技術依據，其中特異性測試在界定權屬中尤為重要。特異性測試需要將待測品種與已知品種庫中所有的品種進行表型性狀比較（通過數據庫或圖片等方法比對），與待測品種有明顯差異的品種不需要田間種植；不能確定與待測品種有明顯差異的，作為近似品種與待測品種進行田間種植比較，通過表型性狀在品種間是否存在明顯差異進行特異性評價。因此，構建已知品種表型數據庫是做好特異性評價的基礎，也是世界各國的通行做法。而DUS測試實踐中，特異性評價仍然面臨一些困難：一是申請人提供的近似品種不準確，甚至故意提供表型差異大的品種；二是申請人在技術問卷中提供的性狀描述不準確，無法用于精確篩選近似品種；三是玉米、水稻、小麥等主要農作物生態區較廣，不同測試分中心的表型數據直接比較時存在環境誤差。

2 DNA分子標記技術在DUS測試中應用的前提和模式

UPOV對DNA分子標記技術在DUS測試中的應用采取了積極而審慎的態度，UPOV技術委員會下成立了生化和分子標記技術（BMT）工作組，專門研究DNA分子標記技術的應用模式。在2010年UPOV先后發布了INF17（標記的選擇及數據庫構建）、INF18（分子標記在DUS測試中的可能應用）以及TGP15（生化和分子標記在DUS測試中的應用指南）文件。經過多個成員多年的實踐，總結出兩種應用模式。

2.1 利用與傳統性狀緊密連鎖的分子標記進行性狀測試抗病、抗除草劑等性狀在田間觀測時，或觀測結果不穩定，或需要特殊條件。對于這類性狀的測試，可采用分子標記方法。但其應用前提是分子標記與性狀之間有可靠的連鎖關系，即有標記則有抗性，無標記則無抗性。測試實踐中，務必慎重評價連鎖的可靠性，因為有時會出現反常案例。2018年在烏拉圭舉辦的BMT17次會議上，荷蘭專家報告了I2基因在番茄鐮刀菌抗性中的特殊情況，即所有含有I2基因的品種都具有鐮刀菌抗性，但某些品種不含I2基因也具有鐮刀菌抗性。

2.2 綜合利用表型距離和分子距離管理品種庫該模式將那些與待測品種的表型距離和分子距離低于一定閾值的已知品種作為近似品種與待測品種在田間相鄰種植，進行特異性評價。其應用前提在于確立分子距離與表型距離的關聯程度，確定一個安全的分子閾值，保證高于該分子距離閾值的已知品種與待測品種存在明顯差異（高于特異性判定的表型距離）從而無需進行田間比較。該模式在法國、荷蘭等國的DUS測試領域中廣泛應用并取得了顯著成效。荷蘭、法國、韓國不僅構建了覆蓋SSR和SNP標記的品種DNA指紋庫，還將應用范疇從DUS測試近似品種篩選，已知品種庫樣品更新時的復驗，雜交公式的驗證等拓展到其他領域，如種子純度檢測、品種權糾紛的輔助證據等。

3 DNA分子標記技術在我國DUS測試中的應用及成效

2002年以來，農業農村部科技發展中心牽頭研制了玉米、水稻、小麥、辣椒等20多種作物DNA指紋鑒定標準，并逐步構建了玉米、小麥、水稻、大豆等作物的DNA指紋數據庫。目前，在申請量大、已知品種數量多、生態適應區廣的玉米、小麥、水稻、大豆、油菜等作物的DUS測試中，利用DNA指紋數據管理已知品種庫，輔助篩選近似品種，取得了明顯成效。農業農村部植物新品種測試（濟南）分中心建立了覆蓋全國小麥產區已知品種的DNA指紋數據庫，對2013-2017年總計319份小麥待測品種，利用“表型距離+分子距離”結合的方式篩選近似品種，通過田間種植評價，共檢測出特異性不合格品種38份，占全部申請品種總數的11.9%，有力地打擊了修飾育種或者剽竊品種。此外，農業農村部植物新品種測試中心還組織針對集中測試、申請量較大的大白菜、辣椒、番茄、西瓜、甜瓜等作物構建DNA指紋庫，用于近似品種篩選、真實性鑒定等工作。

4 正確認識DNA分子標記技術應用中的幾個問題

我國以及其他UPOV成員的DUS測試實踐表明，DNA分子標記技術的應用應注意以下幾點。

4.1 DUS測試是品種確權的依據，DNA分子標記方法不是從科學性的角度看，性狀是基因與基因互作、基因與環境互作的結果。DUS測試不僅包含了這些互作，還綜合了基因表達時空特性，在不同生育期進行觀測并做出科學的判定。盡管ISTA、ISF和OECD等國際組織鼓勵DNA分子方法在品種鑒定中的應用，但與基于表型性狀的品種鑒定方法有根本不同。DUS測試對植物群體進行定義，判定一個植物群體是否是品種（具備一致性和穩定性）、是否有別于其他品種（具備特異性，即可區別性），主要針對未知的植物群體；基于DNA分子方法的品種鑒定是對已定義為品種的代表性種子批進行符合性檢驗，判斷是否相符于品種的標準樣品，針對已定義的品種標準樣品。由于有限的分子標記數量和表型性狀表達的復雜性，即使種子批樣品基因型與標準樣品相符，也并不意味著二者表型性狀完全一致。

4.2 DNA分子標記技術在DUS測試中應用的主要目的并非加快授權2016年實施的新修訂《種子法》規定，申請品種權保護、品種審定和品種登記的品種均應符合特異性、一致性和穩定性的要求。新形勢下DUS測試量快速增加，2017年已突破1萬件。為此，有人提議用DNA分子標記檢測的方法替代DUS測試以加快授權。DUS測試是基于表型性狀的測試，由于表型性狀表達的復雜性，分子距離并不等同于表型距離。基于分子距離的特異性測試并不可靠。另外，DUS測試還包括對一致性和穩定性的測試，基于分子性狀的一致性和特異性評價方法不僅存在嚴謹性的問題，其測試成本和效率也遠高于傳統方法。正是由于上述原因，UPOV體系內 DNA分子技術應用的主要目的是管理已知品種庫，以便在特異性評價時盡可能多地排除那些需要田間種植的品種，從而降低人力和物力投入。

4.3 遺傳相似度高低與表型距離無嚴格線性關系以濟南小麥DUS測試為例，對遺傳相似度90%～95%的15對品種進行田間種植，7對品種間無明顯表型差異（不具備特異性），8對品種間有明顯表型差異（具備特異性）；遺傳相似度95%～100%的35對品種中，26對品種不具備特異性，9對具備特異性。此外，遺傳相似度的高低與差異性狀數量多少也無嚴格線性關系（圖1）。科技發展中心近年來接到因分子位點差異數少于審定要求，育種者主動提出復檢的田間種植比對鑒定結果也表明，分子檢測判定“極近似”或“疑同”品種，半數以上有明顯性狀差異。

圖1 具備特異性的樣品中，待測品種與近似品種的遺傳相似度與差異性狀比較

4.4 DNA分子標記技術不能用于一致性評價由于基因型和表型的對應關系尚未解決，現行技術標準所用的有限的標記無法關聯表型性狀，因此只能反映品種內個體間在這些位點上的一致程度，并非表型上的一致性。加之品種內個體之間在遺傳背景上比較接近，現有標準在區分異型株方面顯得無力。由于表型調控的復雜性，不僅涉及基因型，還涉及基因與基因互作、基因與環境的互作，即使增加分子標記也無法判定品種一致性。在2018年BMT17次會議上，以往呼聲最為強烈的美國代表也理性地回歸到UPOV的應用模式。

5 建議

UPOV成員和我國的實踐表明，DNA分子標記技術可以在DUS測試中有用武之地。關鍵取決于如何應用，要達到的目標是什么。為進一步提高DNA分子標記技術的應用成效，提出以下建議。

5.1 考慮作物類型對于申請量大、生態區廣、已知品種數量多的作物，DNA分子標記技術作用非常明顯。但對于存在芽變（部分果樹）、回交（部分水稻等）或高世代分離選種等育種方式的作物，后代與親本遺傳背景非常接近，DNA分子標記技術作用有限。

5.2 標記方法的選擇2018年在BMT17次會議上，與會代表對INF17和TGP15文件進行了修訂，新版本充分考慮了新技術，例如GBS（Genotyping by sequencing）等基于測序的基因分型方法。選擇SSR、SNP還是GBS應綜合考慮標記的可獲取性、技術經驗、成本、數據共享性等多個因素。從UPOV成員的實踐看，一些標記方法可能在同一個實驗室的重復性相對較好，在不同實驗室之間的重現性會因檢測平臺不同而不同，標記選擇應以滿足需求為評價標準。

5.3 技術標準的有效性至關重要DNA分子標準的核心是一套分子標記位點，它是在研制時基于一組（小樣本）表型有差異的品種確定，用于已知品種庫（大樣本）管理。因此，分子標記技術標準研制時的品種樣本數量、表型多樣性以及標記的評價決定了分子標準最終的有效性。

5.4 加強合作從國內水平看，DNA分子標記技術標準應整合技術實力強的單位，聯合品種資源、品種測試單位共同研制，一種作物只出一個高質量的標準，標準應進行有效性驗證；一種作物只構建一個統一共享的品種指紋數據庫，用于品種測試和品種管理。國際方面，荷蘭、韓國、法國等都希望能夠加強合作，共同研制一批國際分子標記技術標準，克服當前不同的國家因采取不同的分子標記技術標準，導致同一品種的指紋數據無法比對的困難。