蛋白質組學在人乳蛋白質研究中的應用

于文皓,祁艷霞,靳 艷

(1. 大連海洋大學食品科學與工程學院, 遼寧 大連 116023;2. 中國科學院大連化學物理研究所, 中國科學院分離分析化學重點實驗室, 遼寧 大連 116023)

人乳是新生兒最理想的天然食物,富含新生兒生長發育所需要的各種重要營養成分[1]。蛋白質是人乳最重要的營養成分之一,人乳中蛋白質含量豐富且種類繁多。人乳蛋白質不僅為嬰兒提供營養,人乳中的乳鐵蛋白、溶菌酶等活性蛋白質還對嬰兒免疫系統的形成、腸道菌群的構建起關鍵作用[2]。人乳蛋白質可分為酪蛋白(casein)、乳清蛋白(whey)和黏蛋白(mucin)3部分,其中黏蛋白也稱為乳脂球膜蛋白(milk fat globule membrane, MFGM)[3]。人乳蛋白質的含量和組成差異不僅存在于個體之間,而且在哺乳期內呈動態變化。人乳中總蛋白質含量隨著哺乳期的延長呈下降趨勢,初乳(產后兩天)中蛋白質質量濃度為14～16 g/L,成熟乳(產后14天后)中蛋白質含量逐漸降低為8～10 g/L。人乳中酪蛋白和乳清蛋白的比例在哺乳期內也是變化的,在泌乳期0～100天的過程中人乳中的蛋白質組分由80%乳清蛋白20%酪蛋白變為乳清蛋白和酪蛋白各占約50%[1]。

長期以來,由于分析檢測方法的限制,對人乳蛋白質的研究大多停留在高豐度蛋白質的層面,對于低豐度蛋白質、翻譯后修飾蛋白的研究非常有限[3]。隨著蛋白質組學技術的發展及其在人乳蛋白質研究中的應用,對人乳蛋白質的研究從宏量營養研究進入微量營養研究階段[4]。蛋白質組學技術目前已經廣泛應用于人乳蛋白質的組成和動態變化研究、人乳中翻譯后修飾蛋白如磷酸化蛋白、糖基化蛋白、人乳與其他物種乳汁的差異比較等研究中。蛋白質組學技術不僅揭示了人乳蛋白質的組成及功能,還用于嬰兒過敏、乳母乳腺癌的診斷等相關疾病的研究[5]。本文對蛋白質組學技術應用于人乳蛋白質研究中的最新成果進行綜述。

1 利用蛋白質組學研究人乳蛋白質組成

1.1 人乳蛋白質組成及動態變化的研究

蛋白質含量是人乳最重要的營養指標之一,目前常采用凱氏定氮法測定人乳總蛋白質含量,并以此作為衡量人乳蛋白質的主要指標。人乳中蛋白質種類較多,乳清蛋白包括α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、乳鐵蛋白、骨橋蛋白等,酪蛋白包括α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白等。由于人乳蛋白質含量是動態變化的,因此單一蛋白質的含量更能真實反映人乳的營養狀況。但是目前常用的蛋白質分析方法如高效液相色譜法、免疫法等均需要蛋白質標準品,而商品化的人乳單一蛋白質標準品非常有限,因此長久以來并沒有較理想的人乳單一蛋白質的含量分析方法。

隨著蛋白質組學技術的發展,蛋白質組學技術也被應用于定量分析人乳中單一蛋白質。陳啟等[6]篩選了來源于人乳α-乳白蛋白的多肽CELSQLLK作為特征多肽,以同位素標記的特征多肽作內標物,建立了LC-MS/MS分析人乳α-乳白蛋白含量的方法。利用該方法分析了447份人乳樣品,其中α-乳白蛋白的含量為300～450 mg/100 g人乳。該方法不受標準品的限制,具有較高的穩定性和特異性,可用于對不同階段的人乳α-乳白蛋白的定量分析。Liao等[7]建立了基于強度的無標記定量方法(intensity-based absolute quantification, iBAQ)結合LC-MS/MS定量分析人乳中3種酪蛋白。該方法根據LC-MS/MS無標記定量的質譜數據計算3種酪蛋白所占比例,再根據總氨基酸的含量分別計算3種酪蛋白的濃度。利用該方法分析88份人乳樣品的酪蛋白,3種酪蛋白的質量濃度分別為:α-酪蛋白,0.04～1.68 g/L;β-酪蛋白,0.04～4.42 g/L;κ-酪蛋白,0.10～1.72 g/L。該方法的特點在于:(1)改變了將酪蛋白與乳清蛋白分離后再分別測定蛋白質含量的傳統分析方式,利用蛋白質組學的方法直接對樣品進行分析,避免了因分離不徹底而導致測定含量不準確的問題;(2)用肽基N-糖苷酶(peptidylN-glycosidase F, PNGase F)脫除蛋白質上的糖基,避免蛋白翻譯后修飾對準確性造成影響。利用該方法測定的乳清蛋白與酪蛋白的比例為45∶55～97∶3,乳清蛋白與酪蛋白的比例隨著哺乳期延長而升高,這一結論與目前所認為的乳清蛋白與酪蛋白的比例隨哺乳期延長而降低的結論截然相反,該方法是否準確反映了酪蛋白與乳清蛋白比例還需更多數據的驗證。

人乳的組成在哺乳期內呈動態變化,定量蛋白質組學技術已應用于人乳蛋白質在哺乳期的動態變化研究中。Zhang等[8]利用串聯質譜標記(tandem mass tag, TMT)的定量蛋白質組學技術,研究了人乳乳清蛋白在一年內的變化規律。在10位乳母的人乳樣品中共鑒定到1 333個乳清蛋白,對其中615個乳清蛋白在一年的哺乳期內的變化規律進行定量跟蹤研究。結果表明,人乳中糖蛋白的豐度在哺乳期內的變化與人乳中酶的表達水平相關;在哺乳后期,脂肪酸合成酶和硫酯酶的豐度上調,而載脂蛋白和血管生成素相關蛋白的豐度下調,說明人乳中的脂肪酸在哺乳初期主要來源于血液,隨著哺乳期延長逐漸轉變為來源于乳腺內合成。Zhang等[9]利用二甲基同位素標記的LC-MS/MS技術,定量研究了人乳蛋白質在哺乳期6個月內的變化規律。分別定性和定量了247和200個乳清蛋白,來源于不同個體、不同哺乳期的人乳樣品中的乳清蛋白種類呈現高度相似性(重疊率為80%);定量研究的結果表明,個體和哺乳期引起人乳乳清蛋白含量的差別;同時發現,乳鐵蛋白等活性蛋白質的含量變化與嬰兒消化系統和免疫系統成熟程度密切相關。利用蛋白質組學技術研究人乳單一蛋白質含量變化及其與個體、哺乳期的相關性,不僅可以揭示人乳蛋白質變化的生理學意義,還可以深入了解嬰兒的營養需求,對于嬰兒配方奶粉的設計與研發具有指導意義。

1.2 人乳蛋白質與牛乳蛋白質的差異研究

牛乳是目前嬰兒配方奶粉的主要基料來源,研究牛乳與人乳的蛋白質差異對于研發更適合嬰兒生長所需的配方奶粉具有重要的意義。Zhang等[10]利用二甲基同位素標記法結合二維線性離子阱靜電軌道阱組合式高分辨質譜(LTQ-Orbitrap),分別分析人乳和牛乳中的乳清蛋白,研究了人乳和牛乳乳清蛋白在泌乳期內的定量變化規律。人乳和牛乳中的酶、轉運蛋白和免疫球蛋白等蛋白質在生物功能上呈現高度相似,但在含量上存在顯著差異。人乳中膽汁鹽激活脂肪酶較為豐富,而牛乳中胰核糖核酸酶更為突出;與牛乳相比較,隨著泌乳期的延長人乳免疫相關蛋白質的減少速度更慢。Yang等[11]利用同位素標記定量(isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)的LC-MS/MS技術,對人和牛的初乳和成熟乳的乳清蛋白進行了研究。在乳清蛋白中共定量了584種蛋白質,其中424種在人乳和牛乳中存在差異;通過GO功能注釋(gene ontology)和KEGG代謝通路(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析兩者的差異蛋白質,這些差異表達的蛋白質參與的KEGG途徑主要涉及補體和凝血級聯反應、對刺激的反應等生物調節;人乳和牛乳的差異乳清蛋白中有20種與酶調節活性相關、13種與免疫相關,結果表明牛乳與人乳在乳清蛋白部分存在較大差異。Yang等[12]用同樣的方法對人乳和牛乳中的乳脂肪球膜蛋白進行了研究,在乳脂肪球膜蛋白中共定量到411種蛋白質,文中討論了這些蛋白質的生理學意義。與二甲基同位素標記法相比,TMT標記和iTRAQ標記法對樣品分級處理,經質譜可以鑒定到更多的蛋白質,因此在人乳中低豐度蛋白質的鑒定中應用更廣泛。

2 利用修飾蛋白質組學研究人乳糖蛋白和磷酸化蛋白

2.1 人乳中糖蛋白的研究

人乳中含有豐富的糖蛋白,人乳中的糖蛋白具有廣譜的抗病菌功能,可以保護嬰兒免受細菌、真菌和病毒等病原體入侵[13-15],因此研究人乳糖蛋白對于嬰兒健康具有非常重要的作用。人乳中乳清蛋白和乳脂球膜蛋白中大多蛋白質都是糖蛋白,酪蛋白中只有κ-酪蛋白是糖蛋白。寡糖是人乳最重要的組成之一,人初乳和成熟乳中的寡糖含量分別為22～24 g/L和12～13 g/L,高含量的人乳寡糖不僅掩蓋了糖蛋白上糖的質譜信號,而且對確認糖基來源造成干擾。為了解決這個問題,Dallas等[16]利用冰乙醇先除去人乳寡糖,再用PNGase F酶對樣品進行脫除糖鏈處理,用碳材料分別富集脫糖鏈樣品和未脫糖鏈樣品中的糖,利用Chip-TOF MS分析糖鏈。比較脫糖鏈樣品與未脫糖鏈樣品,脫糖鏈樣品中比未脫糖鏈樣品中豐度高兩倍以上的糖認定為源于糖蛋白。利用該方法首次鑒定到糖蛋白上的糖鏈52個,其中25個是在人乳中首次發現;在鑒定的52個糖鏈中,65%為巖藻糖,38%為唾液酸,25%既有巖藻糖也有唾液酸。

乳脂肪球膜是在乳中負責包裹甘油三酯形成脂肪球的一類蛋白,約占人乳中蛋白質含量的2%～4%。乳脂肪球膜蛋白是糖基化程度很高的蛋白質,其中乳凝集素和嗜乳脂蛋白等已被證實具有抗菌、抗病毒的功能,因此乳脂肪球膜蛋白近年來受到越來越多的關注[2]。Yang等[17]利用凝集素富集糖蛋白、PNGase F脫除糖鏈的方法制備樣品,利用LC-MS/MS技術研究了人、馬、駱駝等8種哺乳動物的乳脂球膜蛋白的蛋白質N-糖基化情況。在所研究的樣品中共鑒定到399個N-糖基化蛋白的677個糖基化位點,GO分析顯示這些糖蛋白主要來源于細胞的膜組分,其中大部分與刺激、轉運、免疫功能相關。Cao等[18]采用凝集素富集糖蛋白、LC-MS/MS分析、無標記(Label-free)的定量方法研究了人初乳和成熟乳中的乳脂肪球膜蛋白,在初乳和成熟乳的乳脂肪球膜中共鑒定到506個N-糖蛋白上的912個N-糖基化位點,其中有220個N-糖蛋白的304個N-糖基化位點在初乳和成熟乳中差異表達。GO分析顯示這些N-糖蛋白主要來源于細胞器和細胞膜組分,與“蛋白結合”功能相關。通過人初乳和成熟乳中的N-糖蛋白及糖基化位點研究,定性和定量比較了人初乳和成熟乳在糖蛋白組成和生物學功能上的差異。同一研究小組[19]采用同樣的方法分別對人初乳和成熟乳中乳清蛋白的N-糖基化蛋白進行定性和定量研究,在初乳乳清蛋白中鑒定到來源于63個蛋白質上的110個N-糖基化位點,在成熟乳的乳清蛋白中鑒定到來源于53個蛋白質上的91個N-糖基化位點,其中有38個蛋白質的68個糖基化位點在人的初乳和成熟乳乳清中差異表達。

Huang等[20]建立了無標記、多反應監測(multiple reaction monitoring, MRM)定量分析人乳糖蛋白的方法,該方法可定量分析糖基化位點和糖蛋白利用該方法定量分析了3位乳母的成熟乳中α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、免疫球蛋白等5種糖蛋白。該方法可以實現快速獲得指定位點的定量糖基化信息,具有較高的靈敏度和良好的重復性。

2.2 人乳中磷酸化蛋白的研究

人乳中含有大量的磷酸化蛋白質,其中高豐度的β-酪蛋白和αs1-酪蛋白都是高度磷酸化修飾的蛋白質。磷酸化蛋白可與鈣、鋅等離子結合,促進嬰兒腸道對鈣、鋅等元素的吸收[2],因此對人乳中磷酸化蛋白質的研究對于嬰兒健康具有重要意義。Molinari等[21]使用2-DE凝膠電泳技術對人乳蛋白質進行分離,利用質譜鑒定了目標蛋白質磷酸化,比較早產和足月產人乳中磷酸化蛋白的差異。研究發現,隨哺乳期延長早產與足月產乳母的乳液中β-酪蛋白的磷酸化程度呈現差異。在所研究的8位足月乳母中,有7位乳母的乳樣品中β-酪蛋白的磷酸化程度隨哺乳期延長而降低;在所研究的16位早產乳母中,有10位乳母的乳樣品中蛋白質磷酸化程度在哺乳期內未變化,而其他6位乳母的乳樣品中蛋白質磷酸化程度隨泌乳期延長而升高。Froehlich等[22]使用無標記定量的方法結合LC-MS/MS技術,對哺乳第一個月的人乳樣品中蛋白質磷酸化的變化進行研究。結果表明α-酪蛋白、β-酪蛋白、骨橋蛋白和腱蛋白樣蛋白2在哺乳期的含量變化相互獨立,首次在人乳中鑒定到腱蛋白樣蛋白2的磷酸化。蛋白質組學技術的應用使人乳磷酸化蛋白的研究更為深入,不僅發現新的磷酸化蛋白,同時發現孕期的長短影響人乳蛋白質的磷酸化情況。

3 利用蛋白質組學研究人乳中的內源肽

人乳中的蛋白質進入嬰兒體內后一部分被降解為氨基酸供嬰兒生長所需,還有部分蛋白質被降解成為肽在嬰兒體內發揮生物功能,如酪蛋白磷酸肽結合鈣、鋅等離子,促進嬰兒對鈣、鋅等元素的吸收;人乳鐵蛋白肽具有抑制HIV-1反轉錄酶活性[23]、抗菌活性[24]。隨著越來越多源于人乳蛋白質的活性肽被發現,人乳中的內源肽也逐漸受到關注。以肽為研究對象的肽組學是蛋白質組學的重要分支,肽組學技術的應用促使人乳內源肽的研究進入一個新時期。

Wan等[25]建立了超濾富集人乳內源肽、LC-MS/MS分析的人乳內源肽分析方法,從人乳樣品中共鑒定到來源于34個蛋白質的419個內源肽,同時發現內源肽的斷裂呈現明顯的規律性,說明內源肽是蛋白酶作用的結果;利用二甲基同位素標記定量的方法,比較了早產和足月產乳母的人乳內源肽,發現了兩組樣品的人乳內源肽存在明顯差別。Dallas等[26]利用三氯乙酸法富集、質譜分析的方法研究人乳內源肽,共鑒定到300條內源肽,主要來源于β-酪蛋白,而未鑒定到來源于人乳主要蛋白質α-乳白蛋白和重要蛋白質乳鐵蛋白的肽。在所鑒定到的肽中有一部分肽的序列與已知的抗菌肽序列相似,并且首次實驗證實人乳內源肽的體外抗菌活性。這是關于人乳內源肽的早期研究,主要集中在樣品處理、分析方法的研究,對于研究結果的分析也僅限于內源肽來源蛋白的分析層次。

隨著研究的深入,人們的興趣逐漸轉移到人乳內源肽的產生機制方面。Khaldi等[27]利用肽組學技術對產生人乳內源肽的蛋白酶進行了研究。利用三氯乙酸富集、四極桿飛行時間質譜分析的方法研究了兩位乳母的人乳內源肽,根據蛋白酶的特異性酶切規律與分析得到的肽進行比對,結果顯示人乳內源肽是纖溶酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、組織蛋白酶、彈性蛋白酶等蛋白酶作用的結果。Dallas等[28]用同樣的方法研究了早產和足月產乳母的人乳內源肽,結果顯示早產乳母的人乳內源肽的離子豐度、濃度都顯著高于足月產乳母的人乳內源肽,纖溶酶在早產乳母乳汁中的活性明顯高于在足月產乳母乳汁中的活性。這一現象可能與早產乳母的乳腺發育不成熟有關,也可能是為滿足早產兒未發育完全的消化系統所需。Nielsen等[29]利用肽組學技術證明了人乳內源肽是在乳腺內而非在分泌出體外后生成的。研究者將采集的人乳樣品立刻加入抗蛋白酶并冷凍保存,以避免樣品泌出體外后再發生降解。利用肽組學方法對4位乳母的人乳內源肽進行分析,共鑒定到來源于42個蛋白質的1 100個非冗余肽,說明人乳內源肽是在乳腺中就已形成的;利用蛋白酶預測軟件對鑒定到的肽進行分析,結果顯示人乳內源肽的降解大多是纖溶酶作用的結果;在鑒定到的內源肽中有306個肽與數據庫中的已知活性肽序列80%相似,說明人乳內源肽中可能存在大量潛在的活性肽。除了對早產和足月產乳母的人乳內源肽進行研究,Cui等[30]利用肽組學的方法研究了產巨大兒和非巨大兒的乳母的人乳內源肽,共鑒定到來源于34個蛋白質的400條肽段,其中29條肽存在差異,產巨大兒和非巨大兒的乳母的人乳內源肽的差異可能是為了滿足巨大兒的生理需求。

人乳內源肽進入嬰兒消化道后能否抵御消化道酶的降解,是決定內源肽能否在嬰兒體內發揮作用的關鍵因素,因此肽組學技術也應用于對人乳內源肽消化過程的研究。Holton等[31]利用肽組學技術對人乳中的內源肽以及人乳經嬰兒胃消化2 h后產生的肽譜進行分析,結果發現大部分肽經過嬰兒胃消化后依然保持完整的結構,部分內源肽被進一步降解,同時乳蛋白經過消化道蛋白酶的作用又釋放出一些新的肽。通過肽譜比對研究人乳中7種典型蛋白酶在消化道中的活性,結果顯示在人乳中具有活性的蛋白酶經過嬰兒胃消化后依然表現活性,纖溶酶和胰蛋白酶在胃中的活性明顯高于其在人乳中的活性。人乳中的活性肽和活性蛋白質對于嬰兒早期的免疫系統形成至關重要[32],因此以上人乳肽組學的研究中大多都對潛在的活性肽進行了探討[23,26,30,33,34], Sun等[35]和Zhang等[36]從內源肽中發現了一些新的抗菌、降血壓活性肽。目前鑒定到的人乳內源肽絕大多數都來源于酪蛋白,鮮少鑒定到來源于乳清蛋白的內源肽,這樣的結果是自然選擇結果還是技術原因造成的還需進一步研究。

4 人乳蛋白質的研究在健康領域的應用

人乳蛋白質組學的研究不僅與嬰兒營養相關[2],還應用于嬰兒過敏[37]、乳母乳腺炎和乳腺癌等疾病[38]以及人類性別蛋白質組學的研究。

人乳中含有多種與過敏癥狀相關的免疫組分,人乳中IgG-抗原免疫復合物、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白已被證實與過敏和哮喘發病有關[39],人乳中的一些細胞因子如轉化生長因子-β(TGF-β)和白細胞介素-10(IL-10)對患哮喘的兒童有明顯的保護作用[40]。Hettinga等[41]使用蛋白質組學技術研究了過敏性和非過敏性乳母的乳蛋白質,在鑒定到的364個蛋白質中有19個在兩組人乳樣品中存在濃度差異,其中在過敏性人乳中的濃度高于非過敏性人乳中的濃度的蛋白質有:半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、α-胰蛋白酶抑制劑、絲氨酸蛋白酶抑制劑和載脂蛋白。人乳中過敏相關蛋白質的研究將為過敏治療藥物的開發提供依據。

當母親乳腺感染或者身體發生感染時,人乳中會相應地出現免疫和防御蛋白質,因此人乳蛋白質的變化不僅與哺乳期相關,同時也反映了母親自身的健康狀況。利用蛋白質組學研究人乳蛋白質可以追溯到母親的乳腺炎、乳腺癌等疾病情況。Aslebagh等[5]利用蛋白質組學技術研究了患乳腺癌前后、乳腺癌患者與非乳腺癌患者的乳中蛋白質的差異,發現一些蛋白質在組別之間確實存在顯著性差異,說明對人乳蛋白質組的研究有可能應用于早期乳腺癌的診斷及風險評估。

人乳是女性乳房分泌物,人乳蛋白質組學的研究揭示了女性器官的蛋白質,因此人乳蛋白質組學的研究也是性別蛋白質組學(gender proteomics)的一部分,相關的內容可參考綜述[42]。

5 展望

蛋白質組學技術在人乳蛋白質及相關疾病領域的應用研究取得了一些進展,但乳樣品組成復雜、樣品間個體差異大、數據處理量大等問題使人乳蛋白質的研究還不夠深入。對人乳糖蛋白質組學的研究目前僅停留在對不同糖蛋白位點的研究,對其功能及糖鏈結構的研究還未深入開展;對內源肽的研究多集中于其產生機制,對其功能及與嬰兒健康的相關性研究尚屬空白。再者,還未見針對人乳特點的特異性蛋白質組學技術和方法,導致了目前人乳蛋白質組學研究結果存在很大局限,如人乳內源肽的研究中均未檢測到來源于高豐度乳清蛋白的肽,是分析方法的限制還是生理原因造成的還需進一步確認。總之,建立人乳蛋白質特異性的分析檢測方法和數據處理方法,是人乳蛋白質的未來研究方向。

人乳成分中除蛋白質外還有豐富的糖、脂肪等宏量營養素以及維生素、礦物質等微量營養素,將蛋白質組學與脂組學、糖組學等組學技術相結合,開展人乳進化、發育、母嬰健康與疾病的研究,形成人乳系統生物學體系,將從更深層次揭示人乳生物學特性,研究成果對于改善人類生命初期營養健康具有重要意義。