細胞焦亡與糖尿病腎病炎癥關系研究進展*

范增慧，馬鋒鋒，屈 杰,2，李小會,2Δ

1. 陜西中醫藥大學(咸陽712046)； 2.陜西省中醫藥管理局 傷寒學與經方辨治疑難病重點研究室(咸陽 712046)

21世紀初，一種被稱為細胞焦亡的細胞死亡新方式在被沙門桿菌感染的巨噬細胞中被發現[1]。研究[2]表明，細胞焦亡是一種病原誘導的、依賴炎性胱天蛋白酶1/4/5/11(cysteine-dependent aspartrate-specific proteases，Caspase-1/4/5/11)并伴隨炎癥反應的細胞程序性死亡方式。炎性小體激活并活化下游底物天冬氨酸蛋白水解酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,caspase-1)介導后續Gasdermin D(GSDMD)蛋白裂解是細胞焦亡的關鍵。已有研究[3]表明NOD樣受體家族3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptors,NLRP3)、黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)及活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)可通過半胱天冬酶(caspases)誘發細胞焦亡。而GSDMD蛋白是所有炎性caspases的共有底物，可獨立介導白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)等炎癥介質的釋放。炎性caspases在特定位點通過裂解GSDMD，激活其打孔活性是焦亡細胞胞膜破裂、細胞崩解的效應機制。免疫炎癥性疾病糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)由多種炎癥因子介導，炎癥反應是其腎臟慢性損傷的重要因素。炎癥反應貫穿細胞焦亡和DN全程，作為二者的中介，我們可從炎癥反應角度實驗探討DN與細胞焦亡的聯系與發生機制。細胞焦亡可通過外源性感染和內源性損傷信號誘導自發炎癥性疾病DN炎癥反應的發生，但研究尚處于起步階段。本綜述從炎癥小體激活caspase-1誘發炎癥介導細胞焦亡機制及GSDMD蛋白打孔的效應機制角度闡述細胞焦亡在DN中的研究進展。

1 細胞焦亡與凋亡

細胞焦亡具有的細胞核濃縮、染色體DNA降解等形態學特征和依賴Caspases激活的機制使其在研究初期易與凋亡混淆，但在生物學特征及分子機制上仍可與凋亡相鑒別。凋亡發生時伴隨的細胞皺縮、核固縮、凋亡小體形成一系列特征均不會破壞胞膜及細胞器。因此完整結構的細胞胞質無法外流，局部常無炎癥反應。細胞焦亡區別于凋亡最顯著的特征是胞膜完整性破壞而后誘發的一系列炎癥反應。一方面細胞焦亡時由于胞質膨脹，胞膜受力不均，破裂形成1～2 nm的小孔隙，最終導致細胞內容物外流，大量促炎因子釋放誘發炎癥反應，細胞染料可由胞膜破損形成的小孔使細胞核著色，這一特征常可通過核DNA染色陽性來識別；另一方面細胞焦亡伴隨Caspase-1/4/5/11的激活并釋放IL-1β、IL-18,募集更多的炎癥細胞，擴大局部和全身炎癥反應。體內外多種刺激信號使炎性小體發生應答，受體蛋白Pro-caspases和Nod樣受體(Nod-like receptors,NLRs)通過接頭蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)連接或直接識別并結合細菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)被激活，進一步表達并催化IL-1β、IL-18合成、釋放，最終執行焦亡任務[4]。細胞焦亡因依賴的炎性胱天蛋白酶不同而分為經典和非經典兩種途徑。病毒雙鏈DNA和ROS刺激激活NLRP3炎癥小體產生，NLRP3的選擇性應答是高分子復合物Caspase-1形成的一種過程[5]，而Caspase-1是經典細胞焦亡途徑必不可少的特異性依賴物。經典焦亡時胞質從破裂的胞膜外流及由核苷酸內切酶所介導染色體DNA降解均依賴caspase-1的激活，這也成為經典和非經典細胞焦亡鑒別的重要生物學特征。非經典的細胞焦亡則依賴caspase-4/5/11受體,其在胞內識別LPS隨后直接剪切其下游底物GSDMD蛋白形成一種環狀低聚物，該物質通過在質膜上打孔誘導細胞裂解死亡。近期研究[6]發現，由漿膜上控制小分子物質進出的Pannexin-1介導的離子通道開放可能是細胞焦亡的另一重要機制。研究[7]發現非經典的細胞焦亡通過Caspase-4/5/11誘導Pannexin-1斷裂，激活嘌呤能離子門控受體P2X7(purinergic receptor P2X，ligand-gated ion)打開胞膜通道，在細胞膜上形成小孔引起細胞內離子梯度平衡失調，最終誘發細胞焦亡。Derangère等[8]在結腸癌研究中證實細胞外腺苷三磷酸可激活嘌呤能離子門控受體P2X7(purinergic receptor P2X，ligand-gated ion)打開胞膜通道介導炎性復合物的形成誘導細胞焦亡。另外，離子通道開放所導致的K+外流激活NLRP3炎癥小體是其誘導細胞焦亡的另一機制[9]。

2 細胞焦亡與炎癥反應機制研究

2.1 細胞焦亡調控相關炎癥因子

對細胞焦亡超微結構研究得知，細胞焦亡過程中胞膜上微孔和囊泡形成，細胞腫脹、破裂最終發生滲透性崩解，胞質成分外流啟動機體炎性反應，使細胞焦亡成為特殊的細胞炎癥性死亡方式。機體啟動炎性反應是細胞焦亡的重要途徑，炎癥小體持續活化產生的相關白介素和促炎因子促進細胞焦亡發生。因此研究炎癥反應、炎性小體有助于了解細胞焦亡炎癥反應的調控方式。細胞焦亡免疫反應過程中的模式識別受體(pattern-recognition receptors，PRR)包括NLRs受體(NLRP1、NLRP3和NLRC4)、Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)和PYHIN蛋白(AIM2)，其均能直接或間接上調炎癥小體中心分子和IL-1β、IL-18 前體的表達。研究[10]已發現可介導細胞焦亡的炎性小體有：NLRP3、NLRP1、NLRC4、AIM2和TLR4等。

2.1.1 NLRP3炎癥小體 炎癥小體的激活是細胞焦亡發生的關鍵，一些分布在胞漿中的NLRs家族可識別胞內信號活化caspase-1。而NLRP3炎癥體是炎癥反應的核心因子，作為固有免疫細胞內的危險信號感受器之一，目前研究最為廣泛和全面。NLRP3是一種包括支架蛋白NLR、銜接蛋白ASC和效應蛋白炎性半胱天冬酶-1前體(pro cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Pro-caspase-1)等多個蛋白的復合物[11]，其可被多種內源性或外源性配體激活促進炎性因子IL-1β、IL-18的形成和分泌。復合蛋白NLRP3由LRR、NACHT及CARD或PYD 3部分組成[12]。這種結構在炎性小體組裝和蛋白與蛋白間發揮作用尤其重要。接頭蛋白ASC特異性擁有PYD結構域，有利于其與NLRP3中的PYD結構結合進行后續信號傳遞。ASC的特殊結構為caspase-1的激活提供了一個平臺。研究[13]發現NLRP3的激活中ASC出現成核現象導致更多ASC募集。配體被LRR識別后組裝炎癥小體復合體，進而活化NLRP3，接收信號后的NLRP3首先發生結構重排，使PYD與ASC發生作用，ASC可通過CARD-CARD和PYD-PYD結構域相互作用完成NLRP3炎癥小體的裝配和pro-caspase-1的剪切和活化，從而募集Caspase-1介導IL-1β和IL-18的成熟和釋放，誘發炎癥反應及啟動細胞焦亡[14-15]。

NLRP3炎癥小體活化的上游機制與線粒體活性氧(mitochondrial reactive oxygen species，mROS)產生、鉀離子(K+)外流、溶酶體破裂及溶解有關[16]。氧化應激始動靶點-ROS可通過半胱天冬氨酸蛋白酶、溶酶體蛋白酶或內切核酸酶的作用引起細胞焦亡、凋亡和自噬[17]。線粒體來源的ROS可激活NLRP3炎癥小體介導細胞焦亡，因此ROS在細胞焦亡中的作用不可忽視。陳海燕[18]研究發現，鎘暴露下的血管內皮細胞通過氧化應激通路促進線粒體ROS生成，激活NLRP3、增強caspase-1活性和IL-1β的產生介導細胞焦亡。另有研究[19]表明活性氧清除劑N-乙酰半胱氨酸和經小型干擾RNA沉默后的NLRP3或ASC可以有效抑制尼古丁誘導的caspase-1裂解、IL-18、IL-1β產生及原代人主動脈內皮細胞焦亡。另外低濃度鉀離子環境可以活化NLRP3炎癥小體[20]。氯喹還可上調ATP1B3 的表達，抑制鉀離子外流，從而負調控NLRP3炎癥小體復合物裝配從而阻斷NLRP3后續的炎癥反應及其介導的細胞焦亡[21]。一方面NLRP3炎癥小體作為宿主防御和識別病原相關分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMPs)和損傷相關分子模式(danger associated molecular pattern，DAMPs)的重要物質，能保護機體免受病原微生物和內源性危險信號的攻擊[22]；另一方面NLRP3通過介導促炎因子的水解、成熟和釋放啟動過度炎癥反應及細胞焦亡可對機體造成不可逆損傷。

2.1.2 NLRP1、NLRC4炎癥小體 同樣是Caspase-1炎性小體亞基的NLRP1、NLRC4與NLRP3的不同在于其含有CARD結構域，過表達時可以不依賴ASC獨自結合Caspase-1傳導信號[23-24]。NLRP1基因的表達呈多樣性但卻是目前已知的唯一含有pyrin和CARD結構域NLR。NLRP1中的Pyrin結構域間接感知細菌毒素,使宿主細胞Rho家族小G蛋白失活進而以PYD與ASC蛋白結合的方式組裝炎癥小體復合物，介導細胞天然免疫[25]。NLRP1的類型具有多樣性，其同系物眾多，僅是鼠源性NLRP1基因表達就包括3類：NLRP1a、NLRP1b、NLRP1c。Boyden等[26]發現，NLRP1b基因識別LeTx后活化Caspase-1，可誘導細胞焦亡發生。但小鼠巨噬細胞通過NLRP1b識別LeTx并不具特異性。如B6遺傳背景小鼠雖然能表達NLRP1a/b，但不能識別LeTx。研究[27]發現NLRP1在自身免疫性疾病類風濕性關節炎中可通過上調IL-1β介導細胞焦亡。

NLRC4又稱IPAF，主要通過鞭毛蛋白(Flagellin)和三型分泌系統基體蛋白(PrgJ)參與機體抵抗革蘭陰性菌感染過程[28-29]。研究[30]證實NLRC4能識別鞭毛蛋白，可以在低水平細菌載量時參與銅綠假單胞菌感染后caspase-1的活化。NLRC4結構域由N端CARD、C端LRR和中間NOD 3部分組成，正因其N端擁有與接頭蛋白ASC的相同CARD結構域這一特征，使其不依賴接頭蛋白ASC可直接募集和活化caspase-1。但與NLRP1不同，ASC在NLRC4募集caspase-1介導的細胞焦亡過程中仍具有重要作用。在對被沙門桿菌感染的巨噬細胞的研究中發現，NLRC4炎癥小體可誘導巨噬細胞焦亡。ASC缺乏的細胞死亡中Caspase-1的激活量有所減少，白細胞介素IL-1β的分泌量也隨之減少，這說明ASC在NLRC4激活的反應中非必須，但其擁有的CARD結構域會影響促炎反應和細胞死亡反應的劇烈程度[31]。

2.1.3 Toll樣受體蛋白4-TLR4 Toll樣受體4是一類包含N端和C端的I型跨膜蛋白受體。TLR4可識別并結合相應的PAMPs誘導炎癥因子的表達，該過程與脂多糖(LPS)激活TLR4-N端的亮氨酸富集重復序列有關；TLR4-C端是一個包含Toll/IL-1的受體結構域，其信號傳導途徑與諸多白細胞介素具有同源性，因此LPS/TLR4信號轉導成為激活下游信號通路介導炎癥反應和細胞焦亡的研究熱點。TLR4是由脂多糖、輔助受體髓系分化抗原、LRR結構蛋白CD14構成的三聚體受體，常通過啟動信號級聯反應釋放腫瘤壞死因子、IL-6、IL-8等[32]。TLR4介導的細胞焦亡是一個通過裝配NLRP3炎癥小體的間接過程。NLRP3的激活途徑按有無TLR4的參與分為經典和非經典兩種途徑。TLR4作為NLRP3經典的激活通路，其能通過MyD88促進小鼠巨噬細胞中NLRP3的脫泛素化調控細胞焦亡的發生[33]。經典過程為TLR4信號通路激活,促進NLRP3和Pro-IL-1β轉錄水平升高，介導IL-1β和IL-18前體產生預激活階段和NLRP3/ASC/pro-caspase-1蛋白復合物組裝, pro-caspase-1自剪切并活化成caspase-1隨后發揮作用的修飾激活兩個階段[34]。非經典過程由Caspase-4/5/11識別LPS,將Gasdermin D蛋白切割成C端、N端兩部分直接啟動細胞焦亡,不依賴TLR4信號通路。

Toll樣受體的表達具有多樣性，其能夠在多種細胞中表達。LPS對TLR4誘導的上皮細胞、內皮細胞、神經和神經膠質細胞等刺激炎癥因子的釋放，激活機體有效的免疫應答。LPS由結合蛋白LBP運送到單核及巨噬細胞胞膜表面上，再與其受體分子TLR4、CD14、MD-2共同作用，誘導TLR4信號轉導，產生炎癥反應和其他生物學效應[35]。組織來源的CD4+T細胞能夠發生強烈的炎癥反應，這些細胞能表達高水平的前體IL-1β以及NLRP3炎癥體[36]。近期研究[37]發現，CD4+T細胞不僅能釋放促炎因子擴大炎癥反應還能激活NLRP3活化Caspase-1介導細胞焦亡。HIV感染過程中CD4+T淋巴細胞發生焦亡而引起炎癥反應。研究[38]發現使用caspase-1抑制劑可阻斷CD4+T淋巴細胞發生焦亡，保持其數目穩定以維持正常免疫功能。在對由ATP處理和耶爾森菌感染所引起的NLR激活的caspase-1研究發現，NLRs與TLRs均可增強其敏感性引起細胞內caspase-1的激活并產生大量的IL-1β和IL-18，引發炎癥級聯放大反應[39-41]。

2.1.4 AIM2炎癥小體 黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)屬ALRs家族成員，作為權威的炎性小體其結構包括C末端HIN和N端PYD結構域。研究發現,AIM2的激活機制與核周聚集體相關，接頭蛋白ASC與N-PYD結合與此聚集體息息相關。其C-HIN結構域常可直接與病毒、細菌dsDNA結合,利用N-PYD結構與ASC結合活化Caspase-1，介導細胞焦亡。高度特異性的細胞焦亡，最初是在細胞急性損傷檢測中發現，其與NLRs或AIM2啟動細胞內、胞外PAMPs有關。NLRs和AIM2可以觸發由ASC和pro-Caspase-1蛋白復合物的形成，并處理信號以誘導炎癥級聯反應[42]。AIM2炎性體在免疫反應中發揮重要的作用，研究[43]證明缺氧缺血性腦損傷鼠巨噬細胞中，AIM2的Pyrin結構域氨基酸可與ASC結合，對caspase-1 活化和IL-1β釋放啟動免疫應答引起細胞焦亡。AIM2有助于caspase-1的激活，但AIM2調控細胞焦亡的相關機制尚未完全明了。

2.2 焦亡執行終點蛋白-GSDMD

GSDMD蛋白是Gasdermin家族的一員，在免疫細胞和小腸黏膜上皮細胞表面廣泛表達。GSDMD蛋白是所有炎性 Caspase 的共同底物蛋白，GSDMD只能由炎性Caspase激活特異性參與焦亡發生。實驗證實活化的炎性Caspase能夠在Asp276 位點上特異性裂解切割GSDMD蛋白，引起下游炎性反應因子IL-18，IL-1β的成熟和釋放，激發炎性反應及細胞焦亡，從而奠定了GSDMD蛋白作為炎性Caspase底物在細胞焦亡中所發揮的重要作用。細胞焦亡時GSDMD被炎性Caspase切割形成GSDMD-N和GSDMD-C結構域，并發生低聚化。切割產物N端稱效應域是發揮焦亡的主要功能結構域，它具有親脂性和成孔活性。N端能選擇性與質膜的內膜及細菌的膜結合，病原體因胞膜的破壞直接死亡;另一方面蛋白打孔后宿主細胞膜破裂病原體被釋放到內環境中，被宿主的免疫系統識別殺傷。親脂性表現在N端能特異性與細胞上的脂質結合錨定于生物膜上發揮破壞作用。研究[44]對DSDMD的打孔性進行了驗證，細胞焦亡時GSDMD-N不會從細胞膜外破壞細胞的活性，而是與膜結合破壞細胞膜的完整性，導致胞膜內外環境滲透性紊亂，最終保護屏障丟失細胞溶脹破裂。C端具有親水性，對細胞焦亡具有阻遏作用，靜息狀態下C 端與N端通過長環相結合是其抑制細胞焦亡的基礎。Ding、Sborgi等[45-46]在實驗中分別發現細胞發生焦亡后，GSDMD的N端在脂質體上形成蛋白孔洞，顯微鏡下其直徑大約10～20nm。Chen等[47]還發現細胞形成類似“凋亡小體”的“焦亡小體”樣突起。GSDMD介導細胞焦亡的機制還在于其能影響IL-1β/18 的釋放。韓家淮團隊研究證實無論經典或非經典途徑的細胞焦亡都必須依賴焦亡執行蛋白GSDMD的介導。細胞中敲除GSDMD后，Pro-IL-1β仍可被Caspase-1切割成有活性的IL-1β，但細胞焦亡被抑制，回補GSDMD后細胞焦亡仍可發生。這可能與敲除GSDMD阻止了炎性因子分泌至細胞外有關[48]。結果表明GSDMD與IL-1β的成熟無關，但卻是成熟IL-1β、IL-18釋放分泌到胞外的必要條件。這也證實了GSDMD對于細胞裂解和炎性反應擴大的必要性。

3 細胞焦亡與糖尿病腎病

DN是一種代謝炎癥性疾病。炎癥反應在DN慢性腎臟損傷的發展中扮演關鍵角色。腎臟固有細胞：腎小管上皮細胞、腎小球系膜細胞和足細胞的損傷在炎癥介導的DN發病及疾病進展中發揮至關重要作用。焦亡細胞的典型特征炎性小體表達增加、Caspase-1激活及下游促炎因子的大量釋放等又能反向導致DN細胞死亡增加，可以從炎癥反應作為突破口探討DN與細胞焦亡的發生機制。

DN病程中腎臟固有細胞的減少或缺失會導致腎損傷及影響腎小球濾過屏障過濾的正常發揮出現蛋白尿。而細胞焦亡信號通路中的關鍵蛋白ASC、NLRP3、Caspase-1等均與DN腎臟固有細胞死亡息息相關。急性缺血性腎損傷時NLRP3/caspase-1軸激活，炎癥因子和分子釋放導致腎小管上皮細胞形成大量孔洞，細胞焦亡率顯著增加,而使用siNLRP3腺病毒抑制NLRP3及其他白介素表達后焦亡細胞顯著減少[49]。線粒體功能障礙是腎臟的缺血再灌注損傷(H/R)疾病中腎小管上皮細胞損傷的早期事件，H/R損傷時線粒體平衡蛋白DRP1表達上調，活性氧增加，ROS通過NLRP3誘發炎癥介導焦亡。使用線粒體分裂抑制劑(Mdivi-1)能有效減少活性氧產生，抑制腎小管上皮細胞焦亡發生，保護腎臟功能。線粒體功能障礙是腎小球足細胞損傷的早期事件,可通過阻斷線粒體ROS/NLRP3通路，阻止DN細胞炎癥反應及焦亡發生。研究證實，DN的高血糖癥及氧化應激等可導致細胞內線粒體分解代謝增加，活性氧積聚增多，觸發NLRP3炎性小體途徑，最終導致細胞發生焦亡。DN病程中高糖、高胰島素等造成的細胞氧化應激、炎癥反應、線粒體損傷等又是細胞焦亡的危險因素。研究[50]證實miR-497可靶向定位NLRP1直接或間接調節TLR4和NF-kB炎性小體, caspase-1 水平，減少白細胞介素IL-1β的表達抑制細胞炎癥反應保護細胞。李嶸等[51]研究發現miR-497抑制糖尿病并發癥細胞焦亡是通過靶定NLRP1實現，miR-497靶定NLRP1并降低NLRP1-3'UTR報告基因的螢光素酶活性抑制其表達，最終抑制腎小球系膜細胞焦亡。于艷等[52]研究發現，高糖高胰島素培養的HRMC細胞焦亡增多伴隨NLRP1炎癥小體激活增加。利用Western Blot、RT-PCR檢測各組48 h時間段細胞焦亡相關炎癥因子NLRP1、IL-1β、TNF-α、caspase-1 水平等發現，炎癥因子在蛋白表達及mRNA水平表達上與對照組相比均上調。而后對HRMC轉染NLRP1 小干涉RNA(siNLRP1)后，與非轉染組相比發現NLRP1 蛋白水平明顯降低，而后NLRP1炎癥反應軸上的各個炎癥因子的mRNA 和蛋白水平均較非轉染組明顯降低。

4 小結與展望

炎癥小體被激活，而后介導下游介質Caspase-1活化，最終命令終端核心蛋白GSDMD執行打孔效應是細胞焦亡發生過程中必不可少的幾個環節。關鍵物質炎癥小體在細胞焦亡中不可或缺。炎性小體激活的途徑包括：細胞自噬異常、線粒體ROS異常產生及某些金屬離子離子態平衡失調等。如前所述吞噬溶酶體紊亂也參與了NLRP3炎癥小體的激活，但其上游機制是否與細胞焦亡的激活相關聯，是否也參與細胞焦亡進程還有待研究。細胞焦亡作為細胞生命終結的特殊形式，猶如一把“雙刃劍”適度的細胞焦亡有利于保護機體抵抗內外源性危險因素損傷；另一方面，炎癥反應劇烈細胞焦亡過度也是臨床疾病發生和機體嚴重病理損傷的主要因素。炎性小體、胱天蛋白酶在DN細胞焦亡研究中已有所涉及，但研究尚淺；而Caspase底物蛋白GSDMD在DN研究中仍未涉及，其是否發揮作用，怎樣發揮作用依然未知。我們應在完善目前已有研究成果的基礎上，深化打孔效應機制研究的動物和細胞實驗，進一步揭示細胞焦亡調控所涉及的新機制及其與DN的關系，為DN防護和治療提供新靶點。