蘇云金芽胞桿菌生產菌種的篩選

李 梅

(浦城縣投資開發公司，福建 浦城 353400)

蘇云金芽胞桿菌簡稱Bt，它可以用于森林、棉花、玉米、蔬菜、水果以及茶、麻、煙葉等作物害蟲，也可用于貯藏害蟲和環境害蟲的防治，對蔬菜、茶等害蟲的防治效果達90%以上，且符合國家食品A級標準，是目前全世界公認明有效、最有前途的生物農藥。Bt是目前我國生產和銷售量最大的一種生物殺蟲劑。

Bt菌種在長期的生產過程中經常會出現退化導致減產，選育高產高效的生產菌種是每一個Bt生產單位菌種科室的首要任務。本文以用凝膠電泳法檢測毒素蛋白為初篩條件進行大量初篩，再以小菜蛾生物檢測的效價進行復篩。

1 材料和方法

1.1 菌種

WE-2015-1。

1.2 培養基

肉湯培養基：牛肉膏6%、蛋白胨10%、氯化鈉0.1%、瓊脂2% 1.0 MPa滅菌20 min制成肉湯培養基37℃培養2天后檢查無雜菌，接入菌種培養28℃兩天制成出發菌種備用。

搖瓶培養基：花生粉1.0%、黃豆餅粉3.6%、淀粉：0.5%、酵母粉0.5%、硫酸鎂0.1%、碳酸鈣0.1%、氯化鋅0.05%、磷酸二氫鉀0.1%1.0 MPa滅菌30 min。

1.3 紫外線處理

將培養好的肉湯菌種刮入裝有生理鹽水的平皿中，用功率15 W、波長256 nm的紫外燈距離30 cm處照射1 min，然后進行稀釋10-8稀釋自然分離，挑單菌落轉入斜面培養。

1.4 菌種初篩

第一步初篩：將經過紫外線處理并經過自然分離的菌株培養于肉湯斜面28℃培養2天，用品紅染色液涂片染色鏡檢伴孢晶體的形態。保留伴孢晶體形態規則、一致、個體較大的或者有特點的菌株進行下一步篩選。

第二步初篩：經過第一步初篩過的選出的菌株，接入搖瓶培養基培養30℃、220 r/min振蕩培養40 h后用品紅染色液涂片鏡檢生長較好并且用凝膠電泳法檢測毒素蛋白高于出發菌株10%的菌種保留進行下一步的復篩。

1.5 菌種復篩

第一步復篩：將初篩得到的菌株接種到發酵培養基中30℃、220 r/min振蕩培養40 h后鏡檢生長正常，用小菜蛾做生物檢測毒力效價高于原出發菌株10%的菌株保留進行下一步的復篩。

第二步的復篩：將第一次復篩得到的菌株接入100 L的中試罐中培養基中30℃、180 r/min通氣量1∶1條件下培養40 h鏡檢生產正常，用小菜蛾做生物檢測毒力穩定的菌株作為生產菌種或者作為下一步選育的出發菌株。

2 結果與分析

2.1 篩選結果

經過紫外線誘變處理后，挑單菌菌傳斜面培養鏡檢菌株共2100個，第一步初篩留 種率控制在25%左右，第二步初篩留種率控制在30%左右，最后共挑選150個菌落進入復篩。經過兩次復篩，選擇了WE-2015-1-156、WE-2015-1-899、WE-2015-1-1968用于生產和下一步的選育。

2.2 篩選效果

第一步復篩150個菌株發酵平均效價3860 IU/mL，比對照3199 IU/mL高20.66%。

第一步復篩150個菌株中，有15株發酵效價比對照的低15%，占總數的10%；有30株發酵效價比結照的高20%以上，占總數的20%；有52株的發酵效價比對照的高10%以上，占總數的33.66%。

從上述的結果可以看出，初篩得到的菌株大部分是正突變。經過初篩可以大大減少生物檢測量。

2.3 WE-2015-1-156、WE-2015-1-899、WE-2015-1-1968菌株在生產應用

經過多次復篩，得到的菌株WE-2015-1-156、WE-2015-1-899、WE-2015-1-1968 ，在生產中應用WE-2015-1-156共生產120批，平均效價4560 IU/mL，高于去年平均3920 IU/mL，提高了16.07%；WE-2015-1-899生產99批，平均效價4490 IU/mL，比去年提高了14.54%，WE-2015-1-1968生產80批，平均效價4450 IU/mL，比去年提高了13.52%。

3 討論

初篩和復篩各進行兩步，初篩的兩步主要是考慮固體培養基和液體培養基培養時其伴孢晶體可能不一致，初篩采用凝膠電泳法檢測毒素蛋白，是因為此方法快速簡便。能在短時間內處理大量的菌株。

復篩分兩步主是減少生物測定的工作量，用中試罐進行第二次復篩是因為搖瓶與生產的條件存在差異，用小菜蛾進行生物毒力效價測定是為了保證用于生產的菌種銜定用高產。

綜上所述，以伴孢晶體的形態和毒素蛋白的含量為指標，進行固體培養和液體培養兩次初篩，以搖瓶發酵液和中試罐發酵液小菜蛾做生物毒力測定進行復篩，以提高正突變被選 中概率、提高菌種的選育效率，是Bt生產單位菌種選育的一種較好可行的方法。