非變性Ⅱ型膠原蛋白改善骨關節炎的研究進展

王海燕,孫君社,劉愛青,劉 爽,鄒國慶

(1.農業農村部規劃設計研究院,北京 100125;2.北京盛美諾生物技術有限公司,北京 100062;3.海南盛美諾生物技術有限公司,海南文昌 571924)

骨關節炎(osteoarthritis,OA)是一種以關節軟骨的變性、破壞及骨質增生為特征的慢性關節疾病,又稱骨關節病、退行性骨關節病,影響全身大部分關節包括頸腰椎、膝關節、髖關節和指間關節等。骨關節炎是逐漸進展加重性的疾病,目前的治療以延緩病情發展,以減輕疼痛和改善關節功能為目的[1]。薛慶云等[2]選擇了六個中心城市進行調查,結果顯示中國40歲以上人群原發性骨關節炎總體患病率為46.3%,隨年齡增長呈現增高的趨勢,且女性(50.4%)高于男性(41.6%)。預計到2050年,我國60歲以上老年人將達4.8億,占總人口的34.1%,將成為全球老齡化最嚴重的國家,骨關節炎患者數量將會急劇增加,嚴重影響國人的身體狀況和生活質量。

目前改善骨關節炎常用的膳食補充劑有氨基葡萄糖、硫酸軟骨素、乳香、姜黃和魚油等,但是這些膳食補充劑都存在一定局限性,學者們對氨基葡萄糖和硫酸軟骨素改善OA效果存在爭議[3],乳香會引起腸道不適,姜黃生物利用率低,魚油有不耐受和腹瀉的報道[4],因此開發安全有效的功能性原料十分必要。上世紀90年代,非變性Ⅱ型膠原蛋白用于治療類風濕性關節炎,此后又開展了其改善骨關節炎的研究。研究結果表明非變性Ⅱ型膠原蛋白具有方便、安全無毒及抗原特異性等優點,將會成為預防和改善關節炎的革命性功能原料。

1 非變性Ⅱ型膠原蛋白的特點和作用機理

1.1 非變性Ⅱ型膠原蛋白的特點

關節軟骨是覆蓋在滑液關節內骨質表面的一層軟骨組織,呈淺藍白色,半透明,光滑而有光澤,厚1～5 mm,由少量的軟骨細胞和細胞外基質構成。膠原纖維占成人關節軟骨干重的2/3。目前已知正常成人關節軟骨中含有Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅵ型、Ⅸ型、X型、Ⅺ型、Ⅻ型和XIV型膠原,由Ⅱ型、Ⅸ型和XI型膠原組成的異聚體構成軟骨纖維網架結構,其中Ⅱ型膠原占膠原總數的80～90%[5]。Ⅱ型膠原蛋白(collagen typeⅡ,CII)發現于上世紀70年代初,由MILLER從雞軟骨組織分離得到[6]。CII是由3條相同的al(II)鏈構成的同型三聚體超螺旋結構,與其他成纖膠原蛋白如I型和Ⅲ型在氨基酸組成上有一個主要區別,即CII中羥賴氨酸的含量是后兩者的2～4倍,且大部分羥賴氨酸都被糖基化[7]。

非變性Ⅱ型膠原蛋白是以動物軟骨為原料,采用低溫提取技術,得到的完整保留大分子膠原蛋白三螺旋結構未發生變化的膠原蛋白產品,分子量在300000 Da左右。與目前市場上的膠原蛋白產品相比,最大的區別在于目前的膠原蛋白產品實質上都是大分子膠原蛋白經酶解后,三四級結構已經完全破壞的膠原蛋白肽,平均分子量在10000 Da以下。

1.2 非變性Ⅱ型膠原蛋白的作用機理

非變性Ⅱ型膠原蛋白能夠改善骨關節炎的作用機理為口服免疫耐受(Oral tolerance,OT),是指口服某種蛋白質抗原后,導致局部腸相關淋巴組織特異免疫,從而抑制全身免疫應答,是一種外周免疫耐受形式[8],該反應最早報道于1911年,距今已有100年的歷史[9]。

細胞因子在骨關節炎軟骨病變中起了重要作用。骨關節炎發生時,IL-1、IL-6和TNF-α等促炎癥細胞因子增多,影響胞核內基因(如PGE2、NO、MMP、蛋白多糖酶、膠原酶等)轉錄,引起軟骨基質降解和軟骨細胞損傷;而抗炎細胞因子有TGF-β、胰島素樣生長因子-1和IL-4、IL-10、IL-13等,抗炎細胞因子可以增強軟骨組織的修復能力,促進細胞外基質的合成,抑制促炎細胞因子的產生,降低軟骨組織的損傷[10-12]。據研究報道,非變性Ⅱ型膠原蛋白的作用機理是口服后在胃蛋白酶和胃酸作用下,其三螺旋結構部分解螺旋,變成可溶性大分子結構,到達小腸Peyer’s淋巴結,經腸道內的抗原肽細胞APC在細胞內將外源性抗原非變性Ⅱ型膠原蛋白進行加工、處理,并形成MHC-抗原肽復合體,然后遞呈在APC的表面,激活調節性T細胞產生抗炎癥因子TGF-β、IL-4、IL-10,下調T細胞攻擊關節內膠原活性,從而減輕疼痛和炎癥[13-15]。此外還有研究發現,非變性Ⅱ型膠原蛋白的主要抗原區域分別為末端區域、螺旋區域和a鏈的中心位點,其抗原肽表位大多數定位于250～273這一段序列[11,16]。

2 非變Ⅱ型膠原蛋白改善骨關節炎的研究

早在上個世紀90年代,已經有美國學者研究了非變性Ⅱ型膠原蛋白改善關節炎的研究,近年來國內也開展了Ⅱ型膠原蛋白的相關研究。

2.1 國內外關于非變性Ⅱ型膠原蛋白改善關節炎的動物實驗研究

2.1.1 國內關于非變性Ⅱ性膠原蛋白改善關節炎的動物實驗 中國最早研究非變性Ⅱ型膠原蛋白改善關節炎的是朱平等[17],他們于1999年采用牛軟骨Ⅱ型膠原蛋白飼喂佐劑關節炎SD大鼠,發現其可以推遲佐劑關節炎大鼠發病,降低發病率,明顯減輕病變關節的炎癥反應和縮短病程,并在此后實驗中證明了口服CII能夠誘導小腸派爾淋巴結產生調節性T細胞[18]。徐東紅等[19]2005年對骨關節炎大鼠灌胃雞CII,從大鼠OA軟骨降解、基質金屬蛋白酶13和組織蛋白酶K水平三項指標評價比較其對大鼠骨關節炎改善。結果發現治療性灌胃雞CII不能完全阻止,但可顯著延緩大鼠OA軟骨降解,并能降低基質金屬蛋白酶13和組織蛋白酶K水平,預防性灌胃雞CII效果比治療性用藥更佳;而對照組布洛芬對軟骨降解及基質金屬蛋白酶13和組織蛋白酶K水平無明顯影響。根據實驗結果,作者得出雞CII可能成為治療OA藥物的結論。陳麗娟等[20]2013年用大青鯊CII灌胃佐劑關節炎SD大鼠,發現其能通過灌胃誘導免疫耐受,減少遲發型超敏反應,使循環免疫復合物呈陰性,顯著提高IL-10的水平,修復踝關節軟骨表面損傷,顯著增加CD4+T淋巴細胞Fas/Apo-1的數量。

2.1.2 國外關于非變性Ⅱ性膠原蛋白改善關節炎的動物實驗 國外對非變性Ⅱ型膠原蛋白改善動物關節炎研究也很多。Carin等[21]2004年將實驗動物分為3組:殼聚糖組1 mg,牛CII組1 mg,殼聚糖+牛CII組各1 mg,研究發現殼聚糖可以減少胃蛋白酶對CII的降解,殼聚糖+CII組提高了Peyer’s淋巴結和脾中的IL-10含量,降低了IL-2含量,提高了TGF-β、IL-4、IL-10的mRNA水平,證實了非變性Ⅱ型膠原蛋白能夠通過改變免疫因子改善關節炎癥狀。

Peal等[22]2007年以骨關節炎犬為實驗動物進行了研究,飼喂非變性Ⅱ型膠原蛋白120 d和停止飼喂后30 d分別進行評估。從總體疼痛、跛行時疼痛、運動時跛行評分結果顯示,安慰劑組無效果,而實驗組可以顯著降低骨關節炎造成的疼痛;但停止飼喂后30 d,疼痛恢復至原來水平。

Gupta等[16]2009年以骨關節炎馬為研究對象,探討雞非變性Ⅱ型膠原蛋白改善骨關節炎的效果。實驗分為安慰劑組,雞非變性Ⅱ型膠原蛋白320、480、640 mg/d,氨糖+硫酸軟骨素(5.4+1.8) g,實驗時間150 d。從總體疼痛、跛行和運動能力評分結果顯示,安慰劑組無效果,雞非變性Ⅱ型膠原蛋白組能夠明顯減低關節疼痛,其中480 mg和640 mg組效果相同;氨糖和硫酸軟骨素組也可以降低關節疼痛,但效果不如雞非變性Ⅱ型膠原蛋白組。

此后Gupta等[23]2011年研究了雞非變性Ⅱ型膠原蛋白對中度骨關節炎犬的改善。實驗分為安慰劑組,雞非變性Ⅱ型膠原蛋白40 mg/d,氨糖(2000+1600) mg硫酸軟骨素/d,雞非變性Ⅱ性膠原蛋白+氨糖+硫酸軟骨素/d,實驗時間150 d。觀察結果顯示,三個給藥組都能夠降低疼痛,但只有雞非變性Ⅱ型膠原蛋白能夠降低由骨關節炎導致的疼痛,這說明其作用機理與氨糖和硫酸軟骨素不同,值得注意的是雞非變性Ⅱ性膠原蛋白+氨糖+硫酸軟骨素組也不具有降低由骨關節炎導致疼痛的作用。

Lorenzo等[24]2013年研究了豬Ⅱ型膠原蛋白對關節炎模型鼠的作用,劑量分別為1、3和10 mg(kg·d),實驗時間13 d。通過足壓試驗和痛覺測量顯示,實驗組可以顯著降低骨關節炎疼痛,且劑量越低,效果越明顯;能夠緩解姿勢不平衡,全面改善運動靈活性,降低血液和尿液中的CTX-Ⅱ水平。

Bagi等[25]2017年研究了雞非變性Ⅱ型膠原蛋白對半月板切除后骨關節炎模型大鼠的作用,實驗分為正常組,對照組,假手術組及實驗組雞CII 0.66 mg/d,實驗時間8 w。實驗結果發現,與對照組對比,雞非變性Ⅱ型膠原蛋白能夠保護脛骨干骺端網狀骨質的完整性,抑制骨贅形成和關節的退化。

2.2 國內外非變性Ⅱ型膠原蛋白改善關節炎的人體試驗

世界上最早關于非變性Ⅱ型膠原蛋白改善關節炎的實驗發表于1993年的《Science》。哈佛醫學院的David等[26]1993年采用隨機雙盲方法評價雞胸軟骨非變性Ⅱ型膠原蛋白改善關節炎效果,關節炎患者60人,實驗周期3個月。實驗結果顯示,與安慰劑組相比,實驗組關節腫脹、疼痛的癥狀明顯減輕,15米步行時間明顯縮短。

此后David等[27]2009年分別采用WOMAC法、VAS法和Lequesne法評價雞胸軟骨非變性Ⅱ型膠原蛋白改善關節炎效果,實驗周期90 d,關節炎患者52人,每天服用雞胸軟骨非變性Ⅱ型膠原蛋白40 mg或者氨糖(1500+1200) mg硫酸軟骨素,實驗結果顯示,非變性Ⅱ型膠原蛋白組與氨糖和硫酸軟骨素組改善骨關節炎有效率分別為33%/14%、40%/15.4%、20%/6%,可以看出非變性Ⅱ型膠原蛋白效果明顯好于氨糖和硫酸軟骨素。Robert等[12]2015年采用開放實驗,共17名關節炎患者參加,每天口服雞胸軟骨非變性Ⅱ型膠原蛋白20 mg+來自啤酒花的THIAAs 300 mg,實驗時間12 w。調查問卷結果顯示,服用2 w后即有明顯改善效果,12 w后所有人疼痛改善明顯。James等[28]2016年采用隨機雙盲多中心,并用WOMAC法,VAS法和Lequesne法評價雞胸軟骨非變性Ⅱ型膠原蛋白對關節炎的作用,實驗分為非變性Ⅱ型膠原蛋白組40 mg/d,氨糖(1500+1200) mg硫酸軟骨素組/天,安慰劑組,關節炎患者191人,實驗周期180 d。實驗結果顯示非變性Ⅱ型膠原蛋白組的WOMAC值與安慰劑組和氨糖+硫酸軟骨組相比有顯著差異,療效明顯好于安慰劑組和氨糖+硫酸軟骨素組,并且疼痛、晨僵和生理功能改善效果也十分明顯。

中國也開展了非變性膠原蛋白改善關節炎的人體試驗。徐建華等[29]2006年采用隨機雙盲實驗,評價口服雞Ⅱ型膠原蛋白對關節炎患者的作用,關節炎患者55人,口服雞Ⅱ型膠原膠囊90 μg/d或甲氨蝶呤10 mg/w,試驗24 w。實驗結果發現,口服CII能明顯改善患者的休息痛、晨僵、壓痛關節指數、腫脹關節指數、患者評價、日常生活能力、血沉和C反應蛋白。

有文獻報道適量運動具有顯著促進正向免疫調節的作用[30],但如果長期從事大強度的運動訓練,會發生強烈的運動性免疫抑制現象[31]。為了評價非變性Ⅱ型膠原蛋白對健康人群關節是否有作用,James等[32]2013年采用隨機雙盲方法進行實驗,每天服用非變性Ⅱ型膠原蛋白40 mg或安慰劑,健康人數55人,實驗120 d。結果發現,健康人服用非變性Ⅱ型膠原蛋白90 d后,膝關節伸展角度從基礎值(73.2±1.9) °提高到了(78.8±1.9)°(p=0.045),120 d后實驗組膝關節伸展角度提高到了(81.0±1.3) °(p=0.002),而安慰劑組120 d后膝關節伸展角度為(74.0±2.2) °,與基礎值統計學無明顯差異。通過實驗結果,作者認為非變性Ⅱ型膠原蛋白能夠延長健康人群的劇烈運動無痛時間,并能夠降低健康人群由于運動造成關節疼痛的可能性。

通過以上研究可以發現,無論是動物模型還是臨床試驗,都可以證明非變性Ⅱ型膠原蛋白能夠降低關節疼痛,提高運動靈活性,減輕關節炎癥狀,且其作用機理是口服免疫耐受,不同于氨基葡萄糖和硫酸軟骨素。非變性Ⅱ型膠原蛋白主要通過調節免疫因子來抑制炎癥發生,修復受損關節,實驗效果也好于氨基葡萄糖和硫酸軟骨素。

3 非變性Ⅱ型膠原蛋白的前景展望

2016年國家衛計委批準非變性Ⅱ型膠原蛋白(又更名為含Ⅱ型膠原蛋白軟骨粉)以雞胸軟骨為原料,經清洗、消毒、粉碎后加入氯化鉀,在低溫條件下烘干后得到的含膠原蛋白的軟骨粉,可作為普通食品生產經營。該產品質量指標按照企業標準執行,衛生安全指標按照GB2762、GB29921執行。2017年盛美諾公司通過了非變性Ⅱ型膠原蛋白的SC許可,成為目前國內唯一一家能夠規模化生產非變性Ⅱ型膠原蛋白的企業。在美國,由Lonza集團控股Interhealth公司生產的UC-Ⅱ?非變性Ⅱ型膠原蛋白已經在維骨力、鈣爾奇等產品中得到了應用,在日本非變性Ⅱ型膠原蛋白作為關節支撐的功能性食品宣稱已經得到了批準[33]。

年齡是OA發病的最主要危險因素,隨著中國老齡化程度日益加劇,骨關節炎患者將明顯增加,亟需改善骨關節炎癥狀的功能性原料。非變性Ⅱ型膠原蛋白已經被批準作為普通食品生產經營,降低了市場準入門檻,便于產品推廣應用。該產品有助于加強關節健康,緩解關節疼痛,促進關節靈活性,預防骨關節炎發生,提高骨關節炎患者的生活質量和身心健康,必將會成為改善關節炎的革命性功能原料,市場開發前景廣闊。