烏龍茶做青過程中細胞變化研究進展

陳文鳳，郭雅玲

（福建農(nóng)林大學 園藝學院，福建 福州 350002）

烏龍茶是六大茶類之一，以其天然濃郁的花果香型和醇厚回甘的品種韻味有別于其他茶類，兼具綠茶的清爽高香和紅茶的鮮濃醇厚，素以滋味醇厚、花香濃郁、品種繁多而聞名天下，有著“茶中香檳”的美譽。其制作工序為：攤青、做青、殺青、揉捻、包揉、干燥。做青是形成烏龍茶獨特品質(zhì)的關鍵工序，也是奠定烏龍茶獨特香氣和滋味的基礎。

做青是搖青和靜置交替進行的過程，做青過程相當于機械伴隨水分脅迫的逆境條件，植物在逆境條件下體內(nèi)發(fā)生一系列的生理生化變化[1]。做青引起的機械損傷以及水分的適度散失，一方面刺激了細胞內(nèi)各種內(nèi)含物的轉化，另一方面也為離體葉片營造了一個逆境環(huán)境，促使細胞內(nèi)發(fā)生微妙的變化，如細胞膜透性改變、多酚類物質(zhì)氧化、物質(zhì)水解、脂質(zhì)降解、葉綠素破壞等，這些變化為烏龍茶獨特品質(zhì)的形成奠定基礎[2]。

做青葉細胞內(nèi)部的研究主要集中在做青過程中細胞結構變化、酶活性變化、脂質(zhì)過氧化等[3-4]；近幾年，隨著茶樹分子生物學的快速發(fā)展，也展開了對烏龍茶做青葉片內(nèi)部的分子機制的初步研究[5]。

1 烏龍茶葉片結構的獨特性

制作茶葉，必須要講究茶鮮葉的適制性，制作烏龍茶的鮮葉要求表面角質(zhì)層和蠟質(zhì)層要厚，防止搖青后出現(xiàn)死青。嚴學成[6]對烏龍茶不同葉位的葉片進行超微結構觀察，發(fā)現(xiàn)適制烏龍茶的茶樹品種鮮葉特征為：從芽下第一葉到第四葉，葉片內(nèi)的葉綠體結構逐漸發(fā)生分化、葉綠體片層增多，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量呈遞增趨勢，第三葉的葉綠體出芽產(chǎn)生原生質(zhì)體，并指出適制烏龍茶各品種的成熟葉普遍存在葉綠體出芽產(chǎn)生原生質(zhì)體的現(xiàn)象，這是適制烏龍茶鮮葉有別于適制其他茶類鮮葉的特性。

2 做青葉細胞內(nèi)部結構變化

做青期間葉片發(fā)生碰撞，使葉片細胞組織損傷與器官發(fā)生變化。黃曉敏[7]對烏龍茶鮮葉與做青葉葉片顯微結構進行比較研究，發(fā)現(xiàn)與鮮葉相比，做青葉片有水紋狀皺縮，葉脈下陷，葉表面粗糙，上表皮角質(zhì)層不清晰，下表皮細胞不完整，海綿組織更加疏松，表明做青使鮮葉內(nèi)部結構發(fā)生變化。

3 做青葉細胞酶的變化

做青的目的是讓葉片內(nèi)發(fā)生適度的酶促氧化，促進做青葉內(nèi)部物質(zhì)轉化與積累，逐步形成花香馥郁、滋味醇厚的內(nèi)質(zhì)和綠葉紅邊的葉底。做青葉內(nèi)的酶活性與做青程度密切相關，做青過程中的內(nèi)源酶活性直接影響成品茶品質(zhì)特征[8-9]。

3.1 氧化還原酶類

多酚氧化酶（PPO）和過氧化物酶（POD）是烏龍茶加工過程中重要的氧化還原酶類。

禹利君等[10]初步探明了烏龍茶做青葉片內(nèi)POD 和PPO 的變化規(guī)律，整葉中的PPO 活性在做青過程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而POD活性則呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢；整葉、葉緣、葉芯這三者的PPO 和POD 活性變化規(guī)律不同，且PPO 與POD 的變化規(guī)律是相反的。黃福平等[11]進一步推測了做青前期PPO 活性的增加并未明顯導致多酚類物質(zhì)下降的原因是做青前期細胞破損率和膜透性都很低，而在做青后期細胞質(zhì)膜通透性增加，使細胞內(nèi)的酶與底物充分接觸，促進多酚類物質(zhì)氧化；并發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)膜透性過度加大會造成多酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)聚合沉積，不利于烏龍茶良好品質(zhì)的形成，指出以不導致做青葉細胞質(zhì)膜通透性急劇增大，引起多酚類物質(zhì)顯著下降為烏龍茶做青適度的生化指標之一。

王爾茂等[12]進行了不同做青方式對內(nèi)源酶的影響研究，發(fā)現(xiàn)POD、PPO 和SOD 活性變化趨勢較一致，總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，做青結束時POD 和PPO 的活性均高于做青前的活性，且手工搖青葉的酶活性顯著低于機械搖青葉的酶活性；SOD 的活性的變化雖然也是先上升后下降的趨勢，但是做青結束后的酶活性要低于做青前時的活性，這是因為做青葉細胞受到外力的脅迫使SOD 活性上升以清除自由基，但隨著搖青次數(shù)的增加，自由基大量上升，導致SOD 活性下降。他指出做青使細胞膜結構遭到破壞，酶與底物的接觸程度影響著茶多酚氧化和其他生化反應的程度，表明做青應講究做青適度，過度做青不利于良好品質(zhì)的形成。

陳敏星[13]也研究了做青過程中做青葉片的PPO、POD 的活性變化，發(fā)現(xiàn)做青葉POD 活性在四搖前一直上升并達到最大，但到做青結束時活性降低，猜測可能是由于做青葉的含水率較低導致的；PPO 活性呈下降上升下降上升的“W”型變化；做青后PPO 和POD 的活性均高于做青前，這與前人研究結果一致。

3.2 水解酶類

3.2.1 蛋白酶

蛋白酶是一種內(nèi)源水解酶，可將茶葉中的蛋白質(zhì)水解成各種氨基酸[14]。王若仲等[15]研究發(fā)現(xiàn)做青可增加葉片內(nèi)蛋白酶的活性，使葉片內(nèi)的可溶性蛋白和氨基酸含量增加。做青前中期，蛋白酶活性葉緣＞整葉＞葉芯；做青結束時，蛋白酶活性葉緣＞葉芯＞整葉。通過做青工藝，適當?shù)恼{(diào)控蛋白酶活性，將有利于可溶性蛋白和游離氨基酸的適度積累，促進烏龍茶優(yōu)良品質(zhì)的形成。

3.2.2 果膠酶

果膠酶的主要作用是分解植物組織細胞壁和細胞間的果膠物質(zhì)，進而使細胞壁解體并增加細胞間的通透性，促進植物組織呼吸作用和物質(zhì)代謝[16]。唐顥[17]對金萱和白葉單樅做青過程中內(nèi)源果膠酶活性的動態(tài)變化進行研究，結果表明：搖青處理酶活性顯著高于不搖青處理，搖青前期酶活性逐漸增強，在第三次搖青結束時達到峰值，且可溶性糖的含量在此期間積累，使得葉質(zhì)變軟，降低了做青葉之間的摩擦強度，保證做青葉能夠順利“走水”，為后續(xù)的可溶性糖的轉化保留以及其他品質(zhì)生化成分的保留奠定物質(zhì)基礎。此后的第四、五次搖青酶活性迅速下降，可能與在制品內(nèi)含物轉化和呼吸代謝有關。

3.2.3 β-葡萄糖苷酶

β-葡萄糖苷酶是烏龍茶香氣前體物質(zhì)釋放過程中的一種重要水解酶，其活性的變化直接影響著制茶品質(zhì)尤其是香氣品質(zhì)的形成[18-21]。張秀云[22]等研究了萎凋做青過程中β-葡萄糖苷酶活性的變化，結果表明，萎凋做青期間β 葡萄糖苷酶活性呈盤峰變化趨勢，做青結束前約2 h達到整個做青過程的巔峰值；做青后期，β-葡萄糖苷酶活性下降，推測可能是因為在臨近做青結束時，茶鮮葉失水較多、細胞膜透性增大、多酚類物質(zhì)的酶促氧化作用增強，氧化還原酶的強活性抑制了水解酶的活性，導致β-葡萄糖苷酶活性降低。陳藝元[23]也對搖青工藝中的酶活性進行了研究，發(fā)現(xiàn)搖青可以提高酶的活性，機械力使細胞內(nèi)的液泡損傷，促進液泡中的糖苷類前體與β-葡萄糖苷酶接觸，酶活性的峰值出現(xiàn)在第一次和第二次搖青完成時，隨后晾青過程中活性下降，此研究結果與張秀云的研究結果基本一致。吳喬[24]等的研究結果表明，β-葡萄糖苷酶的活性在低溫（17℃）條件下被抑制；高溫（27℃）雖然能促進β-葡萄糖苷酶活性的增加，但葉片內(nèi)呼吸作用的增強會增加內(nèi)含物質(zhì)的消耗，不利于烏龍茶良好品質(zhì)的形成；室溫22℃不僅能增加酶活性，而且也能保證做青的品質(zhì)。做青引起的機械損傷以及水分的適度散失，一方面刺激了細胞內(nèi)各種內(nèi)含物質(zhì)的轉化，提高了β-葡萄糖苷酶的活性；另一方面，這種損傷不至于造成細胞死亡，反而通過搖青的“走水還陽”作用維持了細胞的活力，使細胞內(nèi)的物質(zhì)轉化和呼吸作用得到合理控制。

3.2.4 纖維素酶

纖維素酶可使細胞壁降解，從而促進細胞間的物質(zhì)、水分轉運和酶促反應進行。唐顥等[25]對做青期間纖維素酶活性進行研究，發(fā)現(xiàn)做青葉纖維素酶活性高于不做青葉纖維素酶活性，做青葉在二搖前，纖維素酶活性上升快，且可溶性糖含量增加，但隨著搖青次數(shù)的增加，纖維素酶活性減弱，這可能是由于細胞受損增加，多酚類物質(zhì)增多，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀增加，導致酶活性下降?？梢酝茢嘧銮嗲捌冢w維素酶活性的增加為可溶性糖的積累提供物質(zhì)基礎，參與烏龍茶滋味品質(zhì)的形成。

4 做青過程中脂質(zhì)過氧化

植物在正常生長條件下，體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡，當處于各種逆境脅迫時這種平衡被破壞，引發(fā)脂質(zhì)過氧化，導致細胞流動性和通透性發(fā)生改變。

黃福平等[26]等研究結果表明，搖青和自然萎凋均能促進膜脂過氧化產(chǎn)物（丙二醛MDA）積累。陳敏星[13]研究結果表明梅占做青葉在三搖前MDA 含量一直下降，三搖后直到做青結束，MDA 含量持續(xù)上升。溫立香[27]等研究發(fā)現(xiàn)，水分與脂質(zhì)過氧化極顯著正相關，做青葉片隨著做青進程的增加，其細胞內(nèi)部的MDA 含量和自由基H2O2含量持續(xù)上升。

5 線粒體的變化

線粒體是細胞中產(chǎn)生活性氧的一個重要部位，是細胞凋亡的調(diào)控中心，在細胞凋亡中起關鍵作用[28-30]。植物細胞凋亡主要包括植物自身發(fā)育過程中的細胞凋亡和環(huán)境作用影響的細胞凋亡[31]。逆境條件下，當線粒體膜受到損傷時，膜電位就會降低，線粒體膜上的通透性轉化（MPT）現(xiàn)象是線粒體結構功能發(fā)生改變的重要分子機制[32-33]。

溫立香[27]研究了烏龍茶做青過程中線粒體的理化變化，發(fā)現(xiàn)葉片線粒體膜吸光度從鮮葉至做青結束逐漸下降，說明搖青刺激細胞內(nèi)線粒體膜通透性轉化（MPT）的發(fā)生；烏龍茶做青過程中葉片線粒體中的MDA 和H2O2含量都逐漸增加，說明了做青導致葉片線粒體被活性氧毒害。

目前對于烏龍茶做青過程中細胞內(nèi)是否會發(fā)生凋亡現(xiàn)象及與凋亡密切相關的線粒體的變化方面研究鮮少，但在其他植物上的研究已有報道[34-35]，做青相當于一個逆境脅迫的過程，可參考已有逆境對細胞變化影響的研究，將其運用在做青葉內(nèi)部微觀的細胞學研究上，從而揭示烏龍茶做青的內(nèi)在機理。

6 烏龍茶做青過程基因表達

6.1 GGDPS 基因

牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶（Geranyl geranyl diphosphate synthase，GGDPS），是植物萜類物質(zhì)合成途徑中的關鍵酶之一。姚雪倩等[36]等克隆出鐵觀音CsGGDPS 基因并利用實時熒光定量技術檢測該基因在做青過程中的表達模式。結果表明，從鮮葉到曬青葉，該基因表達量較低且增長較慢，但隨著搖青的進程表達量顯著增加，且在殺青前表達量達到最高，約為鮮葉的20倍，推測該基因參與烏龍茶萜烯類香氣品質(zhì)形成。

6.2 CsID 基因

陳丹[37]等克隆與萜類化合物形成相關的異戊烯基焦磷酸異構酶（CsIDI1 和CsIDI2）并利用實時熒光定量PCR 技術檢測此基因在做青過程中的表達變化，發(fā)現(xiàn)做青過程中，CsIDI1 和CsIDI2 基因表達量上升，這與前人的研究結果一致，表明CsIDI1 和CsIDI2 基因在烏龍茶做青過程中受到脅迫促進萜類香氣物質(zhì)的形成。

6.3 CsMVK 基因

王鵬杰[38]等克隆出與萜類化合物形成相關的酶基因（CsMVK 基因）并實時熒光定量 PCR檢測此基因在做青過程中的表達特性，發(fā)現(xiàn)烏龍茶在做青過程中，CsMVK 基因在曬青到一搖過程表達量下降，但經(jīng)過3 次搖青，表達量在殺青前達到最大值，推測 CsMVK 基因在做青過程中受到機械力的損傷使其表達增加，參與茶葉萜類香氣物質(zhì)的形成，這也與前人研究的做青期間可促進香精油的積累相符[39-40]。

6.4 CsTPS 基因

單萜合成酶（monoterpene synthases, mono,TPs）是植物單萜化合物合成途徑的限速酶。王鵬杰[41]等克隆了CsTPS 基因并利用實時熒光定量PCR 技術研究該基因在烏龍茶做青過程中的表達模式，結果表明，該基因從鮮葉到曬青階段表達量顯著增加，曬青葉的表達量是鮮葉的3倍，一搖二搖后表達量下降，三搖和殺青前期表達量顯著上升，且殺青前期表達量是鮮葉的3.8倍，推斷該基因參與烏龍茶香氣品質(zhì)的形成。

6.5 CsNCED 基因

做青過程相當于茶樹葉片處于逆境脅迫的過程，脫落酸在植物逆境脅迫響應中發(fā)揮著重要作用。9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶NCED是植物ABA 生成的關鍵酶，王贊[42]等克隆出與調(diào)控ABA 含量密切相關的鐵觀音CsNCED2基因，并實時熒光定量PCR 檢測此基因在烏龍茶做青過程中的表達模式，發(fā)現(xiàn)從鮮葉到曬青結束，CsNCED2 表達量顯著增加并達到第一個峰值，之后的搖青其表達量下降，到殺青前，CsNCED2 表達量顯著上升，達到最高。說明做青過程此基因表達量顯著增加，激發(fā)了以ABA含量為基礎的氣孔開閉和脅迫氧化應激反應。Cho 等研究發(fā)現(xiàn)NCED 在做青過程中表達存在顯著差異[43]。

7 展望

目前對烏龍茶做青過程中葉片的研究主要集中在葉片的生化成分、葉片內(nèi)的酶、香氣、脂質(zhì)過氧化等的研究上，但對于做青過程中與品質(zhì)形成相關的分子研究尚處于初始階段。近幾年，隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，對于烏龍茶品質(zhì)形成的分子機制研究需要深入到細胞或亞細胞水平上，更精確地去探明烏龍茶品質(zhì)形成的內(nèi)部調(diào)控機制[44-45]。隨著科學技術手段的提升與發(fā)展，烏龍茶做青將從宏觀的工藝研究轉向微觀的細胞學研究，深入探究烏龍茶做青與品質(zhì)關系的內(nèi)在機理，為烏龍茶做青的技術經(jīng)驗提供理論支持，也為烏龍茶工藝優(yōu)化、品質(zhì)提高和高效生產(chǎn)奠定理論基礎[46]。