硝基咪唑類藥物分析方法及其應用研究

孫 惠，楊辛欣，張大方，李超英

（長春中醫藥大學，長春 130117）

硝基咪唑類藥物結構的共同特點是咪唑環上有硝基取代，根據咪唑環上取代基的種類和位置的不同分為不同的藥物。硝基咪唑類藥物具有抗厭氧菌譜廣、殺菌作用強、價格較低，且療效顯著等優點，與其他抗菌藥物聯合應用于臨床各個系統的厭氧菌與需氧菌混合感染。目前國內外已上市的硝基咪唑類藥物主要有甲硝唑（metronidazole）、替硝唑（tinidazole）、奧硝唑（ornidazole）、塞克硝唑（secnidazole）等。

硝基咪唑類藥物療效可靠，不良反應較輕，如消化道不良反應，惡心、嘔吐、頭痛、腹痛等；長期大劑量使用此類藥物不良反應發生率較高且較為嚴重，如變態反應、過敏性休克、泌尿系統損害等[1]。因此，嚴格控制硝基咪唑類藥物含量對臨床應用起著重要作用。目前，此類藥物含量測定方法有滴定法、紫外分光光度計、高效液相色譜法、液相色譜-質譜聯用技術、氣相色譜法、氣相色譜-質譜聯用、化學發光法、電化學方法等方法。本文針對不同方法的優勢進行論述，為硝基咪唑類藥物含量測定提供技術支撐。

1 分析方法

1.1 滴定法 采用的滴定方法為中和滴定，是以指示劑顏色的變化為指標，通過已知酸堿的含量求出未知酸堿的含量。目前《中國藥典》（2015年版）[2]、日本藥局方（The Japanese Pharmacopoeia）（JP17）[3]及《國際 藥 典》（ The International Pharmacopoeia，Seventh Edition）[4]收載甲硝唑原料藥均為中和滴定法，此方法具有快速、方便等優點，但也存在誤差較大，重復性低及靈敏度小等缺點，目前此方法應用于常規分析，如甲硝唑原料藥的一般檢查。

1.2 紫外分光光度法（UV） UV法由于儀器設備簡便、成本低，準確度高及易于操作等優點，已成為藥物必備的檢測設備之一。施春陽等[5]采用雙波長分光光度法測定氯硝唑酊中氯霉素和甲硝唑的含量，根據等吸收點法，確定氯霉素測定波長為277 nm，參比波長為352 nm；甲硝唑測定波長為309 nm，參比波長為243 nm測定氯霉素平均回收率為99.7%，甲硝唑平均回收率為98.7%。該法操作簡便，準確性較好，可不經分離檢測氯硝唑酊中氯霉素和甲硝唑的含量。

目前，UV法主要應用于此類藥物含量、藥物雜質、藥物穩定性、藥物釋放度、藥物負載行為測定及其物質結構鑒定等方面，應用最多的是用于原料藥及制劑的一般含量測定。

1.3 高效液相色譜法（HPLC） HPLC法于20世紀60年代后期引入氣相色譜理論而迅速發展起來，是目前常用藥物檢測手段，具有適用范圍廣、分離效率高、分析速度快和自動化程度高等優點。

李為等[6]建立HPLC法同時測定復方奧硝唑貼膜中奧硝唑和地塞米松磷酸鈉含量的方法，對檢測波長、流動相的種類和比例進行篩選，確定色譜條件為ODS柱，流動相為甲醇-20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，檢測波長為242 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃；所建立的 HPLC 法專屬性強、準確度高，可同時測定復方奧硝唑貼膜中奧硝唑和地塞米松磷酸鈉的含量，適用于該制劑的質量控制。

Michael Cohen-Wolkowiez等[7]建立HPLC法測定干血斑（DBS）中甲硝唑的方法，以DBS為樣品采集工具的新型生物分析方法結合HPLC法形成一種適合于新生兒樣品的選擇性、靈敏的檢測方法，首次報道甲硝唑在新生兒臨床小樣本中的定量方法，為新生兒藥物監控提供檢測手段。辛顯桐等[8]研究甲硝唑經口腔給藥的藥代動力學，研究動物為SD大鼠，給藥劑量為80 mg/kg，采用結扎大鼠食管達到口腔給藥的途徑；實驗表明甲硝唑符合與灌胃大鼠相同劑量的甲硝唑相比所顯示的動力學趨勢是相似的，均符合一級吸收一室模型，但達峰濃度較灌胃給藥低，證實口腔黏膜吸收也是甲硝唑吸收代謝的有效途徑，此給藥途徑可用于甲硝唑口腔疾病。Junichi Iida等[9]測定乳腺癌患者使用甲硝唑軟膏后甲硝唑血藥濃度并且進行分析研究，是從藥代動力學角度研究局部給藥甲硝唑的安全性。實驗結果表明，在該患者中的血漿濃度比正常人吸收高30倍。分析血漿濃度較高的可能是由于潰瘍皮膚的角質層的皮膚屏障功能比正常皮膚吸收差，藥物的侵入和轉移促進了表皮附近的血管吸收，影響藥物的吸收。

康現武等[10]研究甲硝唑緩釋微球結腸溶膠囊在家兔體內的藥代動力學，采用雙交叉實驗設計，分別口服結腸溶膠囊及參比制劑（原料藥），對比2者的藥代動力學過程。結腸溶膠囊組與對照組的Tmax分別為8.5 h和1 h，Cmax 分別為 4.617 μg/mL 和 13.499 μg/mL，實驗采用HPLC方法研究甲硝唑藥代動力學，且證明甲硝唑緩釋微球結腸溶膠囊口服給藥可以在結腸吸收，且具有緩釋、結腸靶向性等作用。

目前，相比于滴定法和UV法，HPLC法測定硝基咪唑類藥物含量方便，快速、準確，專屬性強，結果準確可靠，適用于成分復雜的制劑含量測定、質量控制及體內藥代動力學等研究。

1.4 液相色譜-質譜聯用技術（LC-MS） 液質聯用技術是在20世紀90年代迅速發展的檢測手段，將高效液相的強分離能力與質譜高靈敏度結合，使其具備高選擇性、高靈敏度和強分離性等優點，可根據質譜檢測器類型的不同分為液相色譜串聯四級桿質譜儀、液相色譜串聯飛行時間質譜儀、液相色譜串聯四級桿離子阱質譜儀和液相色譜法串聯傅里葉變換離子回旋共振儀等[11]。目前應用在食品、化妝品、動物飼料及口腔衛生用品中的甲硝唑痕量測定及多成分的體內代謝規律的研究。

Stephani L.等[12]建立同時定量人血漿中甲硝唑和2-羥基甲硝唑的含量測定方法，采用灌胃給予甲硝唑片，通過親水親脂性平衡固相萃取有效提取血漿中有效成分，采用超高效液相色譜質譜（UPLC-MS / MS）方法測定血漿成分，實驗結果表明，建立的方法具有靈敏度高和高效等優點，可以應用于健康人口服甲硝唑片的藥代動力學研究。Shampa Das等[13]探究頭孢他啶、阿維巴坦和甲硝唑3種成分在健康受試者中的隨機藥代動力學和藥物相互作用研究，通過UPLC-MS測定受試者的血液與尿液進行實驗，采用雙交叉設計考察頭孢他啶-阿維巴坦與甲硝唑合用的藥物相互作用關系，根據預定的時間內曲線下面積與每對藥物的最大血漿濃度的比率數據表明臨床上頭孢他啶-阿維巴坦聯用與甲硝唑聯合用藥不僅藥效增強，且無不良反應。

硝基咪唑類藥物廣泛應用于臨床各個領域，但該類藥具有細胞誘變性和動物致癌毒性。硝基咪唑類藥物可以治療和預防動物某些細菌或原蟲疾病，但其在動物組織中殘留已對食品安全構成威脅，楊成對等[14]采用液相色譜-三重四級桿質譜儀同時測定家禽肌肉組織中3種硝基咪唑類藥物（甲硝唑、洛硝噠唑、二甲硝唑）殘留量，實驗結果表明，與其他檢測方法相比，此方法具有分析物響應強、運行時間短、線性范圍寬及檢測限低等優勢。

近年來，甲硝唑因療效明顯、價格低廉，被蜂農廣泛應用于治療和預防蜜蜂孢子蟲病，但是過量的使用極易引起蜂蜜中藥物殘留，對人體健康產生危害。肖國軍等[15]采用液質法同時測定蜂蜜中甲硝唑、氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素4種成分殘留，采用固相萃取柱凈化，正離子和負離子采集模式，增加其測定的準確性，實驗結果表明液質法適用于蜂蜜中4種成分殘留量測定，為蜂蜜的質量控制提供檢測技術。

硝基咪唑類藥物也是臨床治療疥瘡、痤瘡的處方藥，但因其致癌及致突變等毒性，我國禁止將其加入化妝品中，但仍有些商家非法加入使其達到效果，因此應建立合理的硝基咪唑類藥物的檢測方法。張鑫鑫等[16]對祛痘化妝品中5種硝基咪唑類成分（甲硝唑、洛硝噠唑、二甲硝咪唑、羥基甲硝唑和1-甲基-5-硝基-2-羥甲基咪唑）進行測定，采用溶劑萃取和固相萃取柱凈化相結合的方法處理樣品達到減小檢測誤差，并對其樣品處理及萃取過程進行篩選，實驗證明采用液質方法測定化妝品中硝基咪唑類方法可行，達到現有國內外相關法規的樣品檢測要求。

總之，液質聯用技術在硝基咪唑類藥物質量控制、指紋圖譜、結構分析及痕量分析等起著重要的作用。對評價硝基咪唑類藥物制劑的質量、代謝規律、藥物相互作用、安全性及非法添加使用的檢出起著重要作用。

1.5 其他檢測方法 目前，硝基咪唑類藥品檢測方法還有氣相色譜法[17]、氣相色譜-質譜聯用[18]、化學發光法（流動注射化學發光法）[19-20]、電化學方法（銅-金屬有機框架物修飾電極）[21]等檢測方法，由于氣相色譜法對于某些成分需要進行衍生化，不適于直接測定樣品；另外電化學方法方法復雜耗時，故也應用較少。

2 展望

藥代動力學是動力學原理用于藥物的一門邊緣和交叉學科，對闡明藥物體內作用機制、藥效或者藥物毒性大小的基礎和應用研究起著重要作用，為硝基咪唑類藥物臨床應用提供科學依據。目前有關硝基咪唑類藥物的體內外分析方法已經取得顯著進展，應用于結腸定位片、緩控釋透皮給藥制劑等新劑型，體內藥代動力學和釋藥規律研究，使其用藥達到高效、安全及其質量可控目的。本文針對硝基咪唑類藥物各種分析檢測方法及其應用的研究，為開展硝基咪唑類原料、食品、化妝品的研究與應用提供檢測思路與技術。尤其是高效液相色譜技術及液質聯用技術廣泛應用，彌補滴定法及UV法的不足，提高檢測范圍、靈敏度及分離能力。而滴定法及UV法多用于硝基咪唑類原料藥及其制劑的常規分析，有著操作簡單、快捷等優點。因此，應該注重依據此類藥物具體研究和檢測目標設計選擇適宜的分析方法和儀器，才能達到安全、高效、便捷、低成本的檢測目的。