植物源細菌群體感應抑制劑的研究進展

唐甜甜1,許 杰2,*,吳 濤

(1.中國農業科學院農產品加工研究所,農業部農產品質量安全收貯運管控重點實驗室,北京 100193;2.濱州職業學院生物工程學院,山東濱州 256603;3.濱州學院生物與環境工程學院,山東省黃河三角洲野生植物資源開發利用工程技術研究中心,山東省黃河三角洲生態環境重點實驗室,山東濱州 256600)

細菌的耐藥性和耐藥細菌的感染給臨床抗感染治療帶來極大的挑戰,已經成為全球醫療領域最關注的問題之一。目前臨床上廣泛使用的抗生素都是以細菌的蛋白質合成、核酸合成、細胞壁合成和葉酸合成等重要生命代謝過程為靶點,直接殺死微生物或抑制微生物生長,但在這種生存壓力的選擇下,病原微生物逐漸產生耐藥性[1]。因此,有必要尋找新的作用靶點來開發新型抗菌藥物,以對抗不斷出現的耐藥菌株。細菌群體感應(Quorum Sensing,QS)是當細菌數量達到一定濃度才發生的感應現象。研究表明,以細菌群體感應系統為靶標篩選出來的抗菌藥物,即細菌群體感應抑制劑(Quorum Sensing Inhibitor,QSI),只抑制細菌群體感應調控的致病行為,而不直接殺死細菌,不會引起細菌耐藥性的產生,這為發現新的抗菌藥物提供了機會。

近年來,細菌群體感應抑制劑在醫學、農業和食品領域研究已經取得一些進展。一些研究表明,QS參與食品腐敗過程,調控與食品腐敗相關的蛋白質、脂肪、果膠、殼多糖等分解酶活性,并在不同的腐敗食品中檢測出了不同類型的QS信號分子[2]。依據細菌群體感應原理,可以通過調節植物病原細菌致病基因的表達或利用植物共生細菌的群體感應效應來產生一些對提高宿主抗病性、誘導宿主的系統獲得抗性的小分子物質,來對植物病害進行有效的防控,從而提高農業生產效率[3]。因此,干擾群體感應通路讓人們在解決細菌耐藥性、植物細菌性病害、食品腐敗等問題上看到了新的希望。越來越多的研究者通過多種方式從不同來源的生物中篩選群體感應抑制因子,以期找到淬滅細菌群體感應的有效方法。

目前研究最廣的細菌群體感應抑制劑來源包括益生菌、藻類、地衣、植物和動物等,其中集中于植物合成的次生代謝產物作為潛在抗生素抑制微生物的研究較多,包括有生物堿、類黃酮、單寧、香豆素、葡萄糖苷、萜類和酚類化合物等。自然界的植物資源十分豐富,據估計,世界上約有80%的人口依賴植物源藥物治療各種疾病[4]。學者[5]通過分析1995～2014年由國際公認科學數據庫收錄的文獻,統計了來自92個植物科的343種植物對72種細菌的體外抗菌活性研究,其中對菊科、豆科、唇形科和大戟科的植物研究最多,研究較多的細菌有金黃色葡萄球菌、結核分枝桿菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌。因此,在植物中篩選細菌群體感應抑制劑具有廣泛的研究前景。本工作對植物源天然物質作為細菌群體感應抑制劑的研究現狀及其作用方式進行闡述,指出了群體感應抑制劑篩選所存在的問題及其研發前景。

1 群體感應系統概述

細菌根據特定信號分子的濃度可以監測周圍環境中自身或其它細菌的數量變化,當信號分子達到一定的濃度閾值時,能啟動菌體中相關基因的表達,控制或改變細菌的各種生命活動,這就是所謂的群體感應[6]。由于QS可作為菌群的通訊語言調節多種生物學功能,包括微生物被膜形成、毒力因子的表達、抗生素的分泌以及活性物質的生成等病理相關事件[7-8],所以,QS調控系統越來越受到國內外學者的重視。

到目前為止的科學研究證實,在許多單細胞的細菌中,不管是革蘭氏陽性菌(G+)還是革蘭氏陰性菌(G-),都存在著“群體感應”現象。細菌通過分泌自動誘導(Auto-inducer,AI)分子來調節群體感應,通常情況下,革蘭氏陰性菌使用N-酰基高絲氨酸內酯(N-acyl-homoserinelactonase,AHLs)作為自誘導物,統稱為AI-1(Auto-inducer-1),革蘭氏陽性菌通常使用自誘導肽(Auto-inducter peptide,AIPs)來表達,而自誘導物Ⅱ類分子呋喃甲酰硼酸二酯(Auto-inducer-2,簡稱AI-2)則是唯一同時存在于革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌中的自誘導因子,被稱為通用自感體[9]。這些QS信號分子已經在牛肉、豆芽、蕃茄、海產品和牛奶等多種食品中檢測到,并且食物腐敗程度會隨著信號分子濃度的增加而增加[10]。目前,大量關于群體感應的工作在銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、費氏弧菌、哈維氏弧菌、大腸桿菌、霍亂弧菌等致命性病原體中展開,多數研究都集中于AHLs和AIP介導的群體感應。

以AHL介導的群體感應為例,干擾病原微生物群體感應的方式有四種,一是抑制信號分子AHL的生物合成,但是由于信號分子AHL的合成主要是酰氨鏈的合成,所以此途徑在抑制信號分子合成的同時也影響到了脂肪酸代謝過程,很難達到只抑制細菌毒力因子產生而不殺死細菌的目的;二是誘導信號分子降解,已在細菌中發現的降解AHLs群體感應的淬滅酶主要有酰基酶和內酯酶,它們通過裂解AHL信號分子的酰胺鍵或環酯而破壞細胞間的通訊;三是干擾AHL與LuxR型蛋白特異性結合,干擾信號分子與其相應受體蛋白的結合是構建藥物篩選模型的理想靶點,當前報道的大多數QS篩選模型也主要基于這一途徑;最后是通過抑制DNA轉錄[11-12]。

2 植物源細菌群體感應抑制劑

研究表明,植物產生的次生代謝產物會抑制細菌產生致病性的毒素和酶類,并抑制細菌生物膜的形成,對QS系統有一定的干擾作用,這些化學物質存在于植物的許多部位,如樹皮、樹葉、果實和根部等,具有良好的抗菌活性[13]。此外,植物源提取物又因其有效、廉價和安全的特點,已成為抗菌藥物最廣泛的來源之一。

植物源天然提取物可作為細菌群體感應抑制劑主要是由于植物產生的某些次生代謝產物能降解信號受體(如LuxR/LasR)或是產生與細菌QS信號分子有相似化學結構的物質,此物質可直接與信號分子競爭受體,從而阻止信號分子與受體的結合來調節群體感應[14]。植物源QSI化合物主要來源于觀賞、藥用植物、海洋或水生植物以及可食用果蔬,包括各種有機(氯仿、甲醇、丙酮等)提取物以及植物精油,抗菌活性成分主要是酚類、醌類、皂苷、類黃酮、單寧、香豆素、萜與生物堿類等。

2.1 海洋或水生植物

由海洋紅藻(DeliseaPulchra)產生的鹵代呋喃酮是最先發現的并且得到普遍認可的具有抑制QS活性的天然產物,鹵代呋喃酮可通過干擾信號分子AHL與受體蛋白LuxR的結合來影響革蘭氏陰性菌的群體感應系統[15-16]。Quintana等[17]利用紫色桿菌ATCC31532和大腸桿菌pSB401作為生物傳感器,結合圓盤擴散法對加勒比海和巴西海岸的39種海洋生物(26種海綿、7種軟珊瑚、5種海藻和1種植蟲體)提取物的QSI活性進行評價,結果顯示,當用紫色桿菌ATCC 31532作為生物傳感器時,39種提取物中有9種(23%)具有QSI活性,其中7種與海綿有關,當用大腸桿菌pSB401作為生物傳感器時,7種軟珊瑚提取物中有4種具QSI活性,25種海綿提取物中有11種具有QSI活性,此外對海綿進行初步分餾時還發現其中的二氧甾醇和脂質組分可能是良好的群體感應抑制劑來源。

除了從海洋中篩選群體感應抑制劑外,某些水生藥用植物也是良好的抑制劑來源。穿心蓮氯仿提取物能明顯降低銅綠假單胞菌LasI、LasR、rhIL和rhIR等基因的表達[18],且其主要成分穿心蓮內酯可顯著降低禽類致病性大腸桿菌(APEC O78)的AI-2活性,并且可抑制QS調控基因的轉錄水平,降低毒力因子表達,從而減少APEC-O78誘導的肺細胞損傷[19]。水生植物菱角葉提取物的主要成分鞣花酸和阿魏酸具有干擾銅綠假單胞菌的第3種自誘導因子假單胞菌喹諾酮信號(PQS)通路的能力,且菱角葉提取物在最小抑菌濃度下對銅綠假單胞菌產生綠膿菌素和彈性蛋白酶的抑制率高達50%和60%,其中丙酮提取物對其生物膜形成的抑制作用為15%,甲醇提取物對生物膜形成的抑制作用可達20%[20]。

2.2 陸生藥用植物

2.2.1 精油 用蒸餾的方法從植物不同部位獲得的揮發性萜類化合物被稱為精油,具有抗病毒、抗菌、抗真菌、抗炎、抗寄生蟲和抗氧化性能。研究表明,大多數的精油組分(香芹酮、己醛、香芹醇、檸檬醛、香葉醇、肉桂酸、百里酚、丁香酚、肉桂醛等)在其最小抑菌濃度(MIC)下,對紫色桿菌CV026的群體感應系統均有顯著抑制作用,如熒光素的產生及生物膜的形成[21]。薄荷精油中的萜烯類化合物薄荷醇在0.8 mg/mL濃度下,能抑制80%的銅綠假單胞菌產生綠膿菌素,并且可使其生物膜形成率減少69%[22]。牛至精油0.8 mmol/L濃度下對紫色桿菌產生紫色色素的抑制率達高達90%[23],其主要抗QS成分為香芹酚,研究表明香芹酚在3.9 mmol/L濃度時,可使得銅綠假單胞菌中綠膿菌素的產生率減少60%[24]。肉桂精油可干擾以通用信號分子AI-2為基礎的細菌QS,增加其對抗生素的敏感性[25],其主要成分肉桂醛可與熒光假單胞菌的LuxR型蛋白相互作用,阻止AHLs與受體分子結合[10]。此外精油對QS系統抑制作用的研究還在桉樹[26]、檸檬草[27]、百里香[14]等多種植物精油中展開。

基于精油良好的抑菌效果,精油還可作為協同增效劑,將精油及其成分與抗生素聯合使用,會使其應對細菌耐藥性的潛力變得更加明顯,組合效應超過了其單獨使用時各自的作用。苦參葉精油能夠通過氣體接觸將慶大霉素活性提高42.8%,在抗生素治療中有作為佐劑的潛力[28]。Van等[29]也認為精油和抗生素之間存在濃度依賴性的相互作用。抗生素與具有多種愈合特性的天然抗菌物質(如植物精油)組合具有很高的治療潛力,但是抗生素-精油組合對抗藥細菌的作用機制尚不明確,還需進一步深入研究。此外精油與噬菌體、納米顆粒和群體感應抑制劑等不同類型抗菌藥物的組合也是未來研究的熱點。

2.2.2 溶劑提取物 除了用蒸餾方法提取的植物精油外,利用各種有機溶劑(乙醇、氯仿、甲醇等)或水處理植物所獲得的提取液也是良好的群體感應抑制劑來源。玫瑰茶多酚提取物使得紫色桿菌CV026中紫色色素的產生量減少87.56%,且對大腸桿菌K-12和銅綠假單胞菌PAO1生物膜形成的抑制率分別為67.02%和72.90%,并呈濃度依賴性[30]。積雪草乙醇提取物中的乙酸乙酯組分(CEA)在400 mg/mL時可完全抑制紫色桿菌ATCC 12472產生紫色色素,并對其生長無明顯影響,同時,CEA還表現出對銅綠假單胞菌PAO1生物膜形成的抑制作用[31]。蔞葉乙酸乙酯提取物以及其抗QS活性成分植醇,對由QS控制的蛋白酶、生物膜形成和疏水性均有較強的抑制作用[32]。黃連木甲醇葉提取物在2和1 mg/mL濃度下對銅綠假單胞菌PAO1生物膜形成的抑制率分別為92%和79%,其主要的抗QS活性成分為類黃酮,這些類黃酮組分對群體感應信號受體LasR蛋白有較高的親和力[33]。自然界物種資源豐富,越來越多植物的藥用抗菌成分被開發出來,相信在不久的將來會有更多的活性成分應用于臨床研究。

2.3 果蔬植物

果蔬是飲食中非常重要的一部分,在美國,果蔬的消費約占48%市場,但在種植、運輸或儲存期間,果蔬極易受到機械損傷和微生物侵染而導致腐敗變質,從而造成嚴重的經濟損失。細菌侵入果蔬后,會產生導致果蔬損傷的致病物質,如纖維素酶,木聚糖酶,果膠酶,聚半乳糖醇酶,蛋白酶和淀粉酶等。這些酶類通過作物生長過程中的自然開口或受損部位進入宿主組織,降解果蔬中的果膠,纖維素,半纖維素和其他營養成分,導致細胞壞死和組織損傷。而研究表明,這些酶由細菌的群體感應控制[34]。

面對致病菌的侵染,果蔬中也存在多種防御病原體群體感應和抗氧化活性的次級代謝物,如酚類和黃酮類化合物。草莓、葡萄、蘋果和火龍果是很好的酚類化合物的來源,野草莓酚類提取物在其最小抑菌濃度(MCI)下抑制了紫色桿菌群體感應調節的所有表型,包括紫色色素的產生、群集運動和生物膜的形成[35]。不同漿果(蔓越莓、野藍莓、樹莓、黑莓和草莓)和葡萄也顯示出了良好的QSI活性,可作為AHL信號抑制劑,并能顯著降低大腸桿菌和銅綠假單胞菌PAO1的群集運動能力[14]。此外,柑橘類水果也是QSI良好的來源,包括橙子、檸檬、西柚等,柑橘類水果中含有豐富的類黃酮,黃酮已經被證明能夠干擾QS系統相關的生理過程[36],如柚皮苷、香豆素和槲皮素都已被證明是AL-2介導的哈維氏弧菌(V. harveyi)群體感應抑制劑,其中的柚皮苷可顯著降低QS控制的相關表型,如紫色色素生產、生物膜形成和蛋白酶的產生[37],西寧、芹菜素則可抑制V. harveyi BB120和大腸桿菌生物膜的形成[38]。從蔬菜中篩選群體感應抑制劑的研究也很多,如菜花,辣根,蘿卜,豆芽,胡蘿卜,胡椒等,研究表明,香菜精油及其主要化合物芳樟醇具有抗菌、抗生物膜和抗QS活性,其中,香菜精油抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生物膜的形成的MIC值分別為0.8和1.6 mg/mL[39]。

此外,研究表明果蔬中的活性成分結合殼聚糖制成生物可降解薄膜后,其抗群體感應性能會有所增加,黃芩苷和槲皮素類黃酮化合物在用殼聚糖納米包封后,會增強對大腸桿菌群體感應和生物膜形成的抑制活性[40],殼聚糖基辣椒素薄膜的抗群體感應、抗氧化性和疏水性能力會隨著辣椒素濃度的增加而有所改善[41]。

2.4 植物根莖微環境

根際一般是指離根軸表面數毫米范圍之內的土壤-根系-微生物相互作用的微區域,其受植物根系分泌物和周圍土壤微生物影響較大,擁有著巨大的微生物群,包括各種細菌、真菌、原生生物。植物根系與根際微生物一直處于不斷的相互作用中,根際微環境中存在著大量細菌介導的群體感應現象,它們為了適應環境的變化而產生小的化學信號以進行分子間交流,研究表明,與豆科植物相關的大多數根瘤菌都有QS系統,用以調節它們在土壤微生境中的行為,包括與宿主植物建立共生關系[42]。此外,多數植物病原菌都受QS信號分子的調控,能夠產生多種AHLs,例如引起植物塊根、快莖、果實發生腐爛的軟腐歐氏桿菌(ErwiniaAroideae)。

基于植物根系與微生物間相互影響的關系,有不少研究指出從植物根莖部分提取的天然化合物可能具有群體猝滅能力。研究表明,牛蒡根提取物能減弱尿路感染病原體的細菌群體感應[43]。植物蒺藜根水提物對根際相關細菌紫色桿菌有抑制作用[44]。人參水提液可抑制銅綠假單胞菌PAO1中QS控制的LasA蛋白酶、LasB彈性酶等毒力因子的表達,減少AHL分子的合成,其水提液中主要成分為人參皂苷[45]。除此之外,目前關于植物地下根莖研究最多的是大蒜、生姜等辛辣性香料。研究表明,生姜中提取的6-姜醇可通過控制LasR基因表達,調控銅綠假單胞菌介導的菌群感應,影響其生物膜形成[46]。來源于姜科植物的姜黃素可抑制泌尿道病原體(如大腸桿菌)的生物膜形成,用姜黃素處理銅綠假單胞菌PAO1后,其C12-HSL和C4-HSL信號會明顯降低(P<0.05),此外姜黃素還可以與傳統抗生素協同作用克服病原菌的耐藥性,研究表明,姜黃素聯合阿奇霉素和慶大霉素對銅綠假單胞菌QS系統具有協同作用,姜黃素的加入大大降低了阿奇霉素和慶大霉素的最小抑菌濃度(MIC)[47-48]。

除了植物根莖提取物之外,從植物根際土壤中分離出的某些細菌可以產生AHL降解酶,如內酯酶和酰基酶,這些細菌被稱為QQ細菌,酶降解AHLs是一種很有效的干擾QS的方法。最初從番茄根際土壤中分離出來的銅綠假單胞菌2apa(P. aeruginosa)、熒光假單胞菌(P. fluorescens)、粘質沙雷氏菌(S. marcescens)和亞馬遜固氮螺菌(A. amazonense)等生物防治制劑可以用來降低植物病原菌毒力因子的表達,銅綠假單胞菌2apa具有降解AHL的潛力,并能抑制茄科勞爾氏菌(R. solanacearum)生物膜的形成,芽孢桿菌在AiiA基因的作用下可產生內酯酶水解AHL的內酯環。在quiP基因的作用下,銅綠假單胞菌產生的酰基酶可破壞AHLs的酰胺鍵[49]。

3 問題與展望

目前,越來越多的群體感應信號分子(如AHL、AI-2等)在肉、奶、魚、果蔬等多種生鮮食品腐敗基質中檢測到。細菌群體感應作為動植物抗病治療的理想靶點得到了國內外學者的廣泛關注。在這個植物藥物廣泛應用的新時代背景下,植物代謝產物作為群體感應抑制劑則有望成為解決細菌感染以及耐藥性問題的一個有效途徑。抗生素與針對抗性細菌的植物代謝產物的聯合具有不同的作用機制,有希望會成為治療微生物抗藥性的新選擇。

但是群體感應抑制劑也存在許多不確定因素,有研究指出,從自然界得到的天然抑制劑及人工合成抑制劑和有致畸變的效果,因而不能用于工農業和醫藥業。并且,關于一些抑制劑藥物尚不能明確藥物確切的作用靶位,也不能排除所篩選的藥物對宿主是否有不利的影響,尚需深入研究。此外,在自然界中還存在著一些不能自己介導群體感應抑制,需要轉化成另一種物質才成為有效的群體感應抑制劑。所以,關于群體感應抑制劑的研究任重道遠,需要人們不斷地學習和研究以獲得更全面的認識。相信在不久的將來人們可以通過對QS現象的研究,闡明細菌耐藥性和致病性的關系,最終找到一種新型的不會對細菌產生耐藥壓力而又可以消除其致病性的抗菌物質,解決目前與日俱増的細菌耐藥性問題。