miR-16通過靶向調控YAP1基因表達影響肺癌細胞的增殖

周蕓 張筠 樓玉鳳 方力爭

(1浙江大學醫學院全科醫學科，浙江 寧波 310058；2寧波大學醫學院附屬醫院呼吸內科；3浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院全科醫學科)

雖然隨著治療技術手段的不斷發展，但肺癌的遠期生存率仍沒有顯著提高。因此，提高肺癌的早期診斷、早期治療具有重要意義〔1，2〕。miRNA能夠通過負性調控靶基因轉錄，進而參與細胞的增殖、分化、凋亡等多種生物學過程。大量學者通過miRNA芯片技術、微陣列技術、熒光定量PCR等技術手段證實了肺癌腫瘤組織、血漿中存在著多種miRNA的差異性表達，并提示miRNA是肺癌早期診斷的有效指標〔3，4〕。miR-16是較早發現的一種抑癌miRNA，在包括肺癌在內的多種腫瘤組織中低表達，但在肺癌發生發展過程中的具體機制尚未明確〔5，6〕。同時，miRNA在細胞生物學中的作用幾乎都是通過調控靶基因表達來實現的。因此，本研究將探討miR-16對肺癌細胞增殖、凋亡的影響及對相關靶基因的調控作用。

1 材料和方法

1.1細胞株 肺腺癌細胞A549、H1050、H1299，肺鱗癌細胞NCI-H520、NCI H596及人胚肺細胞MIRC-5均購于中國科學院上海細胞庫。

1.2主要試劑和儀器 兔抗人Yes相關蛋白(YAP)1及磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體均購于美國Cell Signal Technology公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒，Hoechst33258染色試劑盒均購于南京凱基生物技術有限公司；Trizol總RNA提取試劑盒，LipofectamineTM3000脂質體，反轉錄試劑盒(第一鏈cDNA合成試劑盒)均購于大連寶生物技術有限公司；miR-16 mimics和miR-16 NC均購于上海吉馬生物技術有限公司；重組質粒pGL3 YAP1 3′UTR-Wt及pGL3 YAP1 3′UTR-Mut購于廣州銳博生物技術有限公司。DYCZ-40D型轉印電泳儀，DYCZ-425D型雙垂直電泳儀均購于北京六一儀器廠；168-1000XC型酶標儀，FACSCalibur型流式細胞儀購于美國BD公司；GelDoc 2000型凝膠成像系統購于美國伯樂公司；IX51倒置顯微鏡購于日本OLIMPUS公司。

1.3細胞轉染 當A549細胞密度達到50%時，利用LipofectamineTM3000脂質體將稀釋好的miR-16 mimics和miR-16 NC轉染到A549細胞中，6 h 后細胞換液并繼續培養48 h，采用RT-PCR法檢測細胞中miR-16的表達。

1.4RT-PCR法檢測細胞中miR-16及YAP1表達 根據Trizol試劑盒說明書提取總RNA，當檢測出的RNA純度良好時候，根據逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA，最后進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.5MTT法檢測細胞活力 將5×103個A549細胞接種到96孔板，培養24 h，按“1.4”轉染48 h后，加入MTT試劑孵育4 h，后舍去上清液，加入二甲基亞砜，微量振蕩器震蕩使結晶物溶解，利用酶標儀檢測OD570 nm值，所測OD值即細胞活力。

1.6軟瓊脂糖克隆形成實驗 將8×103個A549細胞接種到6孔板，培養24 h后，按“1.4”轉染48 h后，消化細胞并制成單細胞懸液。制作1.2%及0.7%的瓊脂糖液，首先將1.2%瓊脂糖與兩倍體積的DMEM培養基混勻，倒于6 cm培養皿，室溫下冷卻。接著0.7%瓊脂糖液與兩倍體積的DMEM培養基混勻后，加入單細胞懸液繼續混勻，后倒于鋪有1.2%瓊脂糖的平皿中，在37℃、5%CO2培養箱中培養，并于顯微鏡下觀察計數。

1.7Hoechst法檢測細胞凋亡情況 將8×103個A549細胞接種到6孔板，培養24 h后，按“1.4”轉染48 h后，用甲醇∶乙酸混合液固定細胞30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，加入Hoechst33258染色液染色10 min，于倒置顯微鏡下觀察，細胞核皺縮，濃染并呈碎片說明細胞凋亡，最后用Image J軟件進行統計分析。

1.8流式細胞術檢測細胞周期 將8×103個A549細胞接種到6孔板，培養24 h后，按“1.4”轉染48 h后，每組收集1×105/ml個細胞，再加入5 μl的Rnase吹打混勻后于室溫下孵育1 h，接著加入PI染液在室溫下避光孵育30 min，最后進行流式檢測，并對細胞周期進行分析。

1.9Western印跡檢測細胞中YAP1表達 收集細胞并裂解，離心收獲上清液獲得總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，蛋白煮沸變性，制作濃縮膠及分離膠，上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳，聚偏氟乙烯(PVDF)膜濕法轉膜。2%的牛血清白蛋白(BSA)室溫下孵育1 h，一抗溶液(兔YAP1及GAPDH單克隆抗體，稀釋度為1∶100) 4℃過夜孵育，第二天在室溫條件下，與二抗溶液孵育1～2 h，在凝膠成像系統中曝光。最后用Quantity one軟件進行統計分析。

1.10熒光素酶報告基因表達分析 將miR-16 mimics+pGL3 YAP1 3′UTR-Wt，miR-16 NC+ pGL3 YAP1 3′UTR-Wt，miR-16 mimics+pGL3 YAP1 3′UTR-Mut，miR-16 NC+ pGL3 YAP1 3′UTR-Mut四組miR-16與YAP1的重組載體轉入SW480細胞中，并根據雙熒光素酶檢測系統檢測每組細胞的熒光素酶活性，計算公式：相對熒光值=螢火蟲熒光素酶熒光值/海腎熒光素酶熒光值。

1.11統計學分析 采用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1miR-16在肺癌細胞株及正常胚肺細胞中的表達 miR-16在A549、H1050、H1299、NCI-H520、NCI H596及MIRC-5中的表達分別為(0.38±0.03)、(1.35±0.01)、(1.10±0.11)、(1.43±0.14)、(1.56±0.15)、(2.38±0.25)。與MIRC-5比較，肺癌細胞中miR-16表達量下調(P<0.01)，且在A549細胞中下調程度最高，因此選為后續實驗研究對象。

2.2miR-16 mimics轉染效果的檢測 miR-16 mimics和miR-16 NC轉染48 h后，與miR-16 NC組(0.36±0.03)比較，miR-16 mimics組中miR-16表達量(1.89±0.12)顯著上調 (P<0.01)。

2.3miR-16 mimics對A549細胞活力及細胞克隆能力的影響 miR-16 mimics和miR-16 NC轉染A549細胞24、48、72 h后，與miR-16 NC組比較，不同轉染時間點miR-16 mimics組細胞活力均顯著降低(P<0.01)。在轉染48 h后，與miR-16 NC組(120.52±12.29)比較，miR-16 mimics組(32.46±3.28)細胞克隆形成數目顯著減少(P<0.01)。見圖1，圖2。

與miR-16 NC比較:1)P<0.01圖1 miR-16 mimics對A549細胞活力的影響

圖2 miR-16 mimics對A549細胞克隆形成能力的影響

2.4miR-16 mimics對A549細胞凋亡及細胞周期的影響 miR-16 mimics和miR-16 NC轉染A549細胞48 h后，與miR-16 NC組比較，miR-16 mimics組細胞凋亡率顯著提高(P<0.01)，且細胞周期阻滯于G1期 (P<0.01)。見圖3，表1。

圖3 miR-16 mimics對A549細胞凋亡的影響(×200)

組別細胞凋亡率細胞周期G1期S期G2期miR-16 NC組5.48±0.5548.21±4.8232.84±3.6818.95±1.90miR-16 mimics組39.63±3.961)62.35±6.231)16.10±1.611)21.55±2.151)

與miR-16 NC組比較：1)P<0.01

2.5熒光素酶報告基因分析 miR-16 mimics+pGL3 YAP1 3′UTR-Wt組的熒光強度低于其他轉染組(P<0.01)，且另外三組間熒光強度差異無統計學意義(P>0.05)。

2.6miR-16 mimics對A549細胞中YAP1蛋白及mRNA表達量的影響 miR-16 mimics和miR-16 NC轉染A549細胞48 h后，與miR-16 NC組(0.98±0.08，0.95±0.05)比較，miR-16 mimics組YAP1蛋白(0.14±0.01)及mRNA(0.10±0.01)表達量顯著下調(P<0.01)。見圖4。

圖4 miR-16 mimics對A549細胞中YAP1 mRNA及 蛋白表達的影響

3 討 論

miRNA是一類高度保守的與靶基因3′UTR區域特異性結合的小RNA分子，其基因組常處于腫瘤基因的脆性區，因此常作為促癌miRNA或者抑癌miRNA參與腫瘤的發生發展〔3，4〕。miR-16基因組定位于13q14.3，是首個被發現與腫瘤密切相關的miRNA。miR-16在血液系統腫瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌等腫瘤組織或血液中低表達，并成為上述癌癥早期診斷的有效指標〔6，7〕。但miR-16在肺癌中的具體作用尚不明確。

本研究結果表明肺腺癌細胞株A549、H1050、H1299，肺鱗癌細胞株NCI-H520、NCI H596中miR-16表達量均顯著低于MIRC-5，此結果與miR-16在肺癌中的表達趨勢一致〔5〕，也與miR-16在其他腫瘤細胞株中的表達趨勢類似〔8～10〕，提示miR-16在肺癌中起抑癌作用。同時，本研究結果表明miR-16 mimics能顯著誘導A549細胞凋亡，與miR-16 mimics在膠質瘤細胞、胃癌細胞中作用效果一致〔8，10〕，從而說明miR-16 mimics能顯著抑制A549細胞增殖，并誘導細胞凋亡。腫瘤細胞的無限增殖源自于細胞周期的紊亂與不可控制，特別是細胞周期調控點G1、S、G2，已經成為眾多抗癌藥物的作用靶點之一〔11，12〕。本研究結果也表明miR-16 mimics能顯著阻滯A549細胞周期于G1期。

miRNA在腫瘤細胞中主要通過調控下游靶基因的轉錄發揮其生物學效應〔8，9〕。本研究前期通過靶基因預測軟件miRanda發現了YAP1可能是miR-16的靶基因之一，miR-16與YAP1的3′UTR區域可能互補，因此本研究對此展開了進一步的驗證。YAP1蛋白是YAP1基因的編碼產物，是一種富含脯氨酸的磷蛋白，含有8種異構體，是Hippo信號通路中的關鍵一員，在包括肺癌在內的多種腫瘤組織中高表達。YAP1通過Hippo信號通路參與細胞的生長、分化與凋亡等生物學過程〔13〕。YAP1在正常生理條件下不表達或者低表達，在被上游信號激活后，能夠極大加速細胞的增殖及惡性轉化。目前對YAP1的了解還有限制，已報道YAP1能與miRNA相互作用進而發揮功能〔14〕。本研究利用熒光素酶報告基因證實了miR-16能夠特異性結合于YAP1的3′UTR區域，使熒光強度降低；同時，RT-PCR及Western印跡結果也說明miR-16能夠負性調控YAP1表達，二者存在靶向調控關系。有研究表明沉默YAP1表達能顯著抑制A549細胞增殖〔15〕，進而說明上調miR-16表達負性調控YAP1表達能夠顯著抑制A549細胞增殖。

綜上所述，miR-16在肺癌細胞株中低表達，上調miR-16表達能顯著降低A549細胞活力及細胞克隆數目，誘導細胞凋亡，阻滯細胞周期于G1期，是通過靶向下調YAP1表達實現的。