血栓心脈寧對血管性癡呆大鼠炎癥因子的影響

付佳宇 劉宏雁 謝宇

(吉林大學 1藥學院藥理教研室，吉林 長春 130021；2口腔醫院修復科)

血管性癡呆(VD)是常見的老年癡呆之一，是腦血管病導致腦損害所引起的獲得性智力障礙的一種臨床綜合征〔1〕。VD的發病機制復雜且誘因較多，目前臨床治療藥物依從性較差且并發癥較多，總體治療效果不理想，因此尋找切實有效、副作用少的藥物是目前研究的主要方向。血栓心脈寧是由丹參、川芎、牛黃、麝香、人參莖葉皂苷等多種中藥材制成的純中藥制劑，具有益氣活血、開竅止痛的作用，臨床上主要用于治療冠心病、心絞痛、腦梗死等疾病〔2〕。本研究組先前實驗表明〔3〕，血栓心脈寧能夠改善雙側頸總動脈結扎大鼠的學習記憶能力，減輕海馬及皮層的病理損傷。劉建偉等〔4〕研究發現，血栓心脈寧對雙側頸總動脈結扎大鼠模型具有明顯的保護作用，其作用機制可能與抑制自由基損傷、改善血小板聚集有關。本研究將進一步闡明血栓心脈寧對永久性結扎雙側頸總動脈大鼠的保護作用，并從炎癥因子方面探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級雄性Wistar大鼠150只，體重250～350 g。由吉林大學白求恩醫學院動物實驗中心提供。合格證號：SCKK(吉)-2013-0001。

1.2實驗藥品及儀器 血栓心脈寧(吉林華康藥業股份有限公司，批號：160404)；甲磺酸雙氫麥角毒堿片(天津華津制藥有限公司，批號：5K837T)；腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(批號：AK0016SEP19006)、白細胞介素(IL)-1β ELISA試劑盒(批號：AK0016SEP19007)、IL-10 ELISA試劑盒(批號：AK0016SEP19008)、轉化生長因子(TGF)-β1 ELISA試劑盒(批號：AK0016SEP19009，晶美生物工程有限公司)。Morris水迷宮裝置(成都泰盟科技有限公司)、EMax Plus酶標儀(Molecular Devices)。

1.3造模和分組 采用永久性結扎雙側頸總動脈法制作VD模型〔5〕，術后14 d將大鼠按體重隨機分為對照組、模型組(均灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉溶液1 ml/100 g)、陽性對照組(甲磺酸雙氫麥角毒堿片，0.54 mg/kg)及血栓心脈寧小、中、大劑量組(0.55、1.10、2.20 g/kg)，連續灌胃給藥9 w。水迷宮實驗期間持續給藥。

1.4水迷宮實驗 連續7 d，前6天在1、2、3、4象限4個不同入水點，測定大鼠到達平臺的潛伏期、游程、朝向角及游泳速度；第7天撤掉平臺，測定大鼠在2 min內經過平臺次數、經過有效區次數、平臺停留時間、有效區停留時間、平臺停留距離、有效區停留距離、平臺停留時間占總時間的百分比、平臺停留距離占總路程的百分比、有效區停留時間占總時間的百分比和有效區停留距離占總路程的百分比。

1.5大鼠腦組織TNF-α、IL-1β、TGF-β1、IL-10含量檢測 水迷宮實驗后，快速取出大鼠腦組織，將組織與冰生理鹽水按1∶9的重量體積比加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。2 200 r/min離心5～10 min，取上清組織勻漿，按測試指標要求分裝后于-20℃冰箱保存，采用ELISA檢測。

1.6統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1Morris水迷宮試驗結果 與對照組比較，模型組第2～6天到達平臺潛伏期及游程明顯延長(P<0.01或P<0.05)，第1～6天朝向角、游泳速度無顯著改變。第7天2 min內穿過平臺、有效區次數明顯減少(P<0.01)。平臺停留距離、平臺停留時間、有效區停留距離、有效區停留時間、平臺的停留時間占總時間的百分比、平臺的停留距離占總路程百分比、有效區的停留時間占總時間的百分比和有效區停留距離占總路程的百分比均明顯降低(P<0.01)。與模型組相比較，血栓心脈寧小劑量組第6天到達平臺游程明顯縮短(P<0.05)，中、大劑量組第3～6天到達平臺的潛伏期及游程明顯縮短(P<0.01或P<0.05)，血栓心脈寧各劑量組第1～6天朝向角、游泳速度無顯著改變。與模型組相比較，血栓心脈寧各劑量組在第7天2 min內穿過平臺、有效區次數明顯增多(P<0.01或P<0.05)，血栓心脈寧小劑量組有效區停留距離、有效區停留時間、有效區停留時間占總時間百分比均明顯增高(P<0.05)，血栓心脈寧中、大劑量組平臺停留距離、平臺停留時間、有效區停留距離、有效區停留時間、平臺停留時間占總時間的百分比、平臺停留距離占總路程的百分比、有效區停留時間占總時間的百分比和有效區停留距離占總路程的百分比均明顯增高(P<0.01或P<0.05)， 見表1～5。

2.2各組腦組織TNF-α、IL-1β、TGF-β1、IL-10含量比較 與對照組比較，模型組腦組織中TNF-α、IL-1β、TGF-β1、IL-10含量顯著升高(P<0.01)。與模型組相比較，血栓心脈寧中、大劑量組TNF-α含量顯著降低(P<0.01或P<0.05)；血栓心脈寧小、中、大劑量組IL-1β、IL-10含量顯著降低(P<0.01);血栓心脈寧大劑量組TGF-β1含量顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表6。

表1 各組潛伏期比較

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；同表2、表5、表6

表2 各組游程比較

表3 各組朝向角比較

表4 各組平均速度比較

表5 各組第7天各項指標比較

表6 各組腦組織TNF-α、IL-1β含量比較

3 討 論

炎癥機制在VD的發病中逐漸受到重視。炎癥反應可修復受損組織，具有神經保護作用，但過度表達則會加重腦組織損傷〔6〕。

當VD時腦組織缺血，內皮細胞和周圍神經元激活釋放大量的前炎癥因子TNF-α、 IL-1β〔7〕。TNF-α和IL-1β是促炎癥的起始調節因子，在觸發炎癥級聯中處于中心位置。TNF-α能夠協同IL-1β誘導其他細胞因子的產生〔8〕。IL-1β還可通過NF-κB途徑促使膠質細胞釋放TNF-α、一氧化氮(NO)等對神經細胞具有毒性的物質〔9〕，從而引起細胞因子、毒性介質的堆積，誘導神經元死亡，從而進一步加重VD。研究發現〔10～12〕，雙側頸總動脈結扎VD大鼠模型腦組織中TNF-α、 IL-1β含量較正常對照組明顯升高。反映TNF-α、IL-1β是加重雙側頸總動脈結扎VD大鼠炎癥反應的重要細胞因子。楊曉霞等〔13〕研究證明，血栓心脈寧能夠明顯抑制缺血再灌注模型大鼠腦組織中TNF-α及其相關因子的分泌和表達，減輕炎癥反應，保護腦組織。TGF-β是一種多功能細胞因子，與TNF-α的變化具有相關性，可影響多種細胞的生長、分化、細胞凋亡及免疫調節等功能〔14〕。李艷玲等〔15〕研究表明，雙側頸總動脈結扎VD大鼠模型腦組織海馬區TGF-β表達增高。IL-10在炎癥反應中主要起激活淋巴細胞的作用。升高時會造成異常碎片在患者腦中斑塊沉積，引起腦內神經毒素的產生，從而引起神經損傷。熊濤等〔16〕研究發現，VD患者血清中IL-10水平與正常對照組相比明顯升高。本實驗結果進一步證實了血栓心脈寧對VD具有保護作用。另外TNF-α、IL-1β、TGF-β1和IL-10作為炎癥因子參與了VD的形成。總之，血栓心脈寧對VD有改善學習記憶的作用，其作用機制可能與對抗炎癥反應、抑制炎癥細胞因子釋放有關，但其確切機制有待于進一步研究。