基于生物信息挖掘MicroRNA-circRNA作為胃癌潛在標志物

韓銀淑

(廈門醫學院，福建 廈門 361023)

胃癌(GC)是世界范圍內臨床死亡率高的惡性腫瘤之一，在全球癌癥死亡率位列第三〔1,2〕，中國是全球GC發病率最高的國家之一〔3〕，GC已對我國人民的健康構成巨大威脅〔4，5〕。環狀RNA(circRNA)是調節基因表達的新型內源性非編碼RNA。主要由內含子和(或)內含子構成，作為非編碼RNA家族的新成員，具有結構性質穩定、物種高度保守性以及組織、細胞的特異性等特征，目前這些RNAs的作用和使命尚未完全揭示〔6〕。與傳統的線性RNA(包括5′端和3′端)不同，circRNA分子處于閉環結構，因此與線性RNA相比，不易被外切核酸酶RNaseR降解〔7〕，更為穩定，更適合作為腫瘤的標志物。一些circRNA分子含有作為競爭性內源RNA(ceRNA)的miRNA反應元件(MRE)，與miRNA結合，circRNA主要通過miRNA海綿作用調控靶基因的表達水平，當其表達上調時，抑制目標基因表達〔8〕。這些非編碼RNA(ncRNA)ncRNA與腫瘤的發生，侵襲和遷移及耐藥密切相關〔9，10〕。在許多研究中，我們發現circRNA與腫瘤的發生密切相關〔11〕。然而，circRNA在GC中的作用尚未闡明。本研究使用miRNA芯片尋找差異miRNA，并預測與GC相關的circRNA，最終確定早期篩查GC的潛在靶標。

1 材料與方法

1.1微陣列芯片分析 使用GEO2R軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)分析miRNA芯片數據。在所有實驗組中，差異表達的基因，miRNA通過顯著性水平P<0.05或| logFC |> 1來鑒定。

1.2miRNA在GC細胞表達驗證 根據組織/細胞miRNA提取試劑盒(海基，中國，B1802)操作步驟常規提取細胞中的miRNA，miRNA反轉錄試劑盒(海基，中國，D1801)逆轉錄成cDNA,根據下列條件進行實時定量PCR，溶解曲線：95℃15 s，60℃15 s，95℃15 s，60℃15 s。引物為hsa-miR-769-5p-正義鏈：GGCTGAGACCTCTGGGTTC，hsa-miR-769-5p-反義鏈：CAGTGCGTGTCGTGGAGT(Invitrogen 中國，上海)。

1.3circRNA-microRNA-基因相互作用網絡 為了進一步闡明基因，microRNA，circRNA之間的相關性，進行潛在的基因-microRNA-circRNA相互作用分析，并用Cytoscape繪制圖譜。

1.4網絡建設和分析 關于miRNA基因相互作用的信息是使用Cytoscape上相互作用的miRNA基因的檢索工具(v.3.5.1)推導。關于miRNA-circRNA相互作用是使用搜索工具(https://circinteractome.nia.nih.gov/)。用miRNA作為目標來預測與circRNA的相互作用，而在預測過程中，我們只保留環境分數百分位≥90%的circRNAs。

1.5統計學方法 應用GraphPad Prism5.0軟件進行方差分析和t檢驗。

2 結 果

2.1通過生物信息學分析鑒定GC的micRNA芯片 使用GEO2R方法的GEO數據庫篩選GC患者的差異表達的micRNA芯片(GSE30070)。我們發現來自正常和GC患者的差異表達的micRNA，其中 93個miRNA上調，64個miRNA下調。將差異最大的前30個上調和下調miRNA以表格形式列出(表1)。

2.2在GC細胞中驗證hsa-miR-769-5p的表達水平 在正常胃細胞(GES-1)和GC細胞系(GES-1、AGS、MKN-45、MKN-28、MGC-803、SGC-7901)及順鉑耐藥GC細胞(SGC-7901/CDDP)中進行驗證，qPCR結果顯示miR-769-5p在正常胃細胞(GES-1)中表達水平較低，在GC細胞系中表達均增高，特別是在SGC-7901表達明顯高于正常細胞。同時，與GES-1細胞相比，miR-769-5p的水平在SGC-7901/CDDP細胞中表達也明顯增加，但低于SGC-7901組(圖1)。

表1 在GC組織差異表達的miRNA

1～7:GES-1、AGS、MKN-28、MKN-45、MGC-803、8GC-7901、SGC-7901/CDDP圖1 miR-769-5p在各細胞中的表達

2.3在GC中miRNA與circRNA的相互作用 在驗證GC和耐藥GC細胞中的差異表達基因之后，我們確定了關鍵調控靶基因，其中下調基因均顯示與miR-769-5p相互作用。因此，我們選擇miR-769-5p為核心調控miRNA，并進一步對其互作靶向circRNA進行預測。同時篩選GSE78092、GSE10070微陣列芯片中GC組織與正常胃組織差異的circRNA，并用circBase(http://www.circbase.org/)分析結果，其中GC組織中有53個circRNAs上調，146個circRNAs下調。在GSE10070芯片中，GC組織中有191個circRNAs上調，522個circRNAs下調〔12〕。表-1列出了這兩個芯片中差異最大的前30個上調和下調的circRNA。我們使用Circular RNA Interactome在線分析軟件(https://circinteractome.nia.nih.gov/)。對于預測結果，我們保留分數百分比≥90%的circRNA，見表2。最后篩選出與芯片共存的circRNA，最終繪制出相互作用的網絡圖，見圖2。

表2 與hsa-miR-769-5p相互作用的circRNA和靶基因預測

圖2 miR-769-5p與circRNA相互作用的網絡圖

3 討 論

circRNA可以作為miRNA“海綿”來調控基因表達水平。因此，我們使用ArraystarcircRNA interaction-miRNA預測軟件來分析circRNA與其靶miRNA的相互作用。結果顯示17個circRNA可以與miR-769-5p結合。此外，我們使用Cytoscape軟件構建了一個完整的miRNA/circRNA相互作用網絡。我們相信這些miRNAs/circRNAs的相互作用存在于GC組織中。因此，在GC中使用circRNA作為潛在的診斷靶標。單獨或與miR-769-5p組合的circRNA可提供更早且更準確的GC敏感性的鑒定。這些結果可以改善GC患者的臨床治療，為藥物治療提供診斷指標。