利拉魯肽對2型糖尿病大鼠胰島β細胞凋亡的調控機制

王宏偉 楊嵐 江思瑜 吳曉光

(河北省中藥研究與開發重點實驗室 承德醫學院中藥研究所，河北 承德 067000)

2型糖尿病(T2DM)的病理機制主要與胰島素抵抗、胰島素分泌不足、炎癥反應、氧化應激、胰島β細胞凋亡等因素相關〔1，2〕。其中胰島β細胞功能在糖尿病患者高血糖調控中發揮著不可忽視的重要作用。研究表明，確診的T2DM患者體內胰島β細胞功能僅殘存50%〔3，4〕，這可能與Bcl-2、Bax、腫瘤壞死因子(TNF)-α、脂聯素、瘦素等因子介導的多種生化反應有關〔5〕。故積極保護胰島β細胞并維持其正常功能成為阻止2型糖尿病進一步發展的有效措施。胰高血糖素樣肽(GLP)-1與其受體結合后，可通過增加胰十二指腸同源框-1基因的表達和活性，促進胰島β細胞增殖，減少其凋亡〔6〕。利拉魯肽作為GLP-1的高度同源類似物，已經成為調節血壓、控制血糖、改善胰島功能等作用的研究熱點〔7〕，但其能否調控胰島β細胞凋亡尚無報道。本研究主要是探討利拉魯肽對T2DM大鼠胰島β細胞凋亡的調控機制。

1 材料與方法

1.1藥品與主要試劑 鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司，批號：16493)，利拉魯肽針劑(丹麥諾和諾德公司，批號：2016624)，抗凋亡蛋白(Bcl)-2抗體、促凋亡蛋白(Bax)抗體、半胱氨酸蛋白酶家庭(Caspase)-3試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司，其余試劑均為分析純。

1.2實驗動物 SPF級SD大鼠60只，雄性，鼠齡80～90 d，體質量210～230 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK(京)2016-0011。

1.3動物分組、造模及給藥 采用隨機數字表法將60只SD大鼠分為正常對照組、模型組、陽性對照組(二甲雙胍，140 mg·kg-1·d-1)、利拉魯肽低劑量組(0.12 mg·kg-1·d-1)和利拉魯肽高劑量組(6.30 mg·kg-1·d-1)，每組12只；正常對照組給予普通顆粒飼料喂養，其余各組均給予高脂高糖飼料喂養8 w進行造模，第9周第1天禁食不禁水12 h，造模各組腹腔注射STZ溶液(30 mg/kg)，正常對照組腹腔注射等體積的枸櫞酸緩沖液；3 d后，造模各組尾靜脈空腹血糖(FBG)≥16.7 mmol/L，并伴有多飲、多尿者視為造模成功，造模各組繼續高脂高糖飼料喂養7 d后，利拉魯肽高、低劑量組皮下注射利拉魯肽；陽性對照組灌胃給予二甲雙胍(140 mg·kg-1·d-1)；正常對照組和模型組均灌胃給予等量生理鹽水(10 ml·kg-1·d-1；1次/d)，連續給藥8 w期間不應用胰島素。

1.4FBG、血清胰島素和抵抗素濃度的檢測 大鼠連續給藥8 w后，禁食12 h，于次日清晨大鼠稱重后，行異氟烷氣體麻醉，采集麻醉后大鼠腹主動脈血，4 000 r/min離心3 min，留取上清，-20℃冰箱凍存。用生化分析儀檢測FBG濃度，ELISA法檢測各組胰島素和抵抗素水平。

1.5胰島β細胞Bcl-2、Bax及Caspases-3蛋白表達水平的檢測 斷頸處死大鼠，剖開腹腔，取出胰腺組織，用0.9%冰生理鹽水沖洗后，用濾紙吸干殘留水分，稱量胰腺組織重量。免疫組化法檢測各組大鼠胰島β細胞Bcl-2、Bax蛋白的表達水平；Western印跡法檢測Caspases-3蛋白的表達水平。

1.6統計學方法 采用SPSS17.0進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組FBG濃度 模型組FBG濃度顯著高于正常對照組(P<0.01)，利拉魯肽高、低劑量組和陽性對照組FBG濃度均顯著低于模型組(P<0.05或P<0.01)，表明利拉魯肽、二甲雙胍均有降糖作用，且降糖作用差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2各組胰島素水平 模型組胰島素水平顯著高于正常對照組(P<0.01)，表明存在高胰島素血癥；利拉魯肽高、低劑量組和陽性對照組胰島素水平均顯著低于模型組(P<0.05或P<0.01)，表明利拉魯肽、二甲雙胍均能有效改善T2DM大鼠的高胰島素血癥、降低胰島素抵抗。見表1。

表1 各組FBG、血清胰島素、抵抗素水平

與正常對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01；表2同

2.3各組抵抗素水平 模型組抵抗素水平顯著高于正常對照組(P<0.01)，表明存在胰島素抵抗；利拉魯肽高、低劑量組抵抗素水平均顯著低于模型組(P<0.05或P<0.01)，表明利拉魯肽能有效改善T2DM大鼠胰島素抵抗；陽性對照組與模型組抵抗素水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.4各組胰島β細胞Bcl-2蛋白表達水平 Bcl-2的陽性表達產物呈黃色或棕黃色。正常對照組胰島β細胞呈深棕色，強陽性表達，模型組胰島β細胞呈淺棕色，陽性表達較弱。與正常對照組比較，模型組胰島β細胞Bcl-2表達水平顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，利拉魯肽高、低劑量組胰島β細胞Bcl-2表達水平顯著增加(P<0.05或P<0.01)，但陽性對照組與模型組比較，增加差異無統計學意義(P>0.05)，表明利拉魯肽能有效提高T2DM大鼠胰島β細胞Bcl-2的表達水平。見圖1，表2。

圖1 各組胰島β細胞Bcl-2蛋白表達水平(×400，免疫組化法)

2.5各組胰島β細胞Bax蛋白表達水平 Bax的陽性表達產物呈黃色或棕黃色。模型組胰島β細胞Bax蛋白呈深棕色，強陽性表達，其染色強度及密度明顯高于正常對照組。與模型組比較，利拉魯肽高劑量組胰島β細胞Bax蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)，表明高劑量利拉魯肽可有效降低T2DM大鼠胰島β細胞Bax蛋白的表達水平；利拉魯肽低劑量組和陽性對照組降低差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2，表2。

2.6各組胰島β細胞Caspases-3蛋白表達水平 模型組胰島β細胞Caspases-3蛋白表達水平顯著高于正常對照組(P<0.01)；利拉魯肽高、低劑量組胰島β細胞Caspases-3蛋白表達水平較模型組有顯著降低(P<0.01)，表明利拉魯肽可有效降低T2DM大鼠胰島β細胞Caspases-3蛋白表達水平；陽性對照組降低差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

圖2 各組胰島β細胞Bax蛋白表達水平(×400，免疫組化法)

組別Bcl-2BaxCaspase-3/β-actin正常對照組1.25±0.220.76±0.180.266±0.035模型組0.95±0.201)0.96±0.141)0.654±0.0471)陽性對照組1.00±0.140.93±0.090.554±0.053利拉魯肽低劑量組1.11±0.192)0.90±0.180.372±0.0233)利拉魯肽高劑量組1.16±0.233)0.85±0.202)0.324±0.0353)

3 討 論

大量的研究表明，T2DM患者體內的胰島β細胞損傷呈進行性加重，這可能與高血糖、炎癥反應、氧化應激等因素有關〔8，9〕。過多的胰島β細胞凋亡將直接影響胰島β細胞的功能，因此抑制胰島β細胞凋亡至關重要。

利拉魯肽具有降低血糖、保護胰島β細胞、減輕體重等作用，目前已廣泛用于糖尿病的治療。但利拉魯肽對胰島β細胞的具體保護機制尚待明確。有研究證實〔10〕，利拉魯肽可通過抑制胰島β細胞凋亡，增加胰島β細胞數目，改善胰島素抵抗。本實驗提示利拉魯肽能夠有效改善胰島素的抵抗作用和有效抑制胰島β細胞凋亡。

Bcl-2蛋白家族位于線粒體膜外，以線粒體作為靶目標調控細胞凋亡，在細胞凋亡調控機制中占有重要地位，其主要分為Bcl-2和Bax。正常情況下，兩者相互制約，處于動態平衡〔11〕，共同參與調控線粒體通透性轉換孔(MPTP)的開放與關閉，即促凋亡蛋白Bax可通過結合跨膜腺嘌呤核苷酸轉運蛋白(ANT)或電壓依賴性陰離子通道(VDAC)介導MPTP的開放，下調線粒體跨膜電位，增強細胞色素(Cyt)C釋放，使CytC進入胞質與凋亡蛋白激活因子(Apaf)21形成結合體，招募并激活Caspase-9，引發與Caspase-9相關的級聯反應，進一步激活處于凋亡關鍵環節的下游因子Caspase-3，從而啟動凋亡程序，導致細胞凋亡；而抗凋亡蛋白Bcl-2則能夠與促凋亡蛋白Bax競爭性地結合ANT或直接阻止促凋亡蛋白Bax結合ANT，造成MPTP關閉，保護線粒體電位梯度，從而抑制線粒體跨膜電位下降，阻止CytC釋放和Caspases級聯反應“瀑布式”放大，最終避免細胞凋亡發生〔12～15〕。Caspases存在于胞質溶膠中，可高度選擇性切割蛋白質，有11種分型，其中Caspase-8、9、10參與細胞凋亡起始，Caspase-3、6、7參與細胞凋亡執行，被稱為“死亡執行蛋白酶”，尤以Caspase-3作用突出，其作為諸多凋亡通路的共同下游效應部分，對其進行檢測更能預測凋亡的早期事件〔16〕。當出現凋亡信號時，Caspase-8、9、10可自身活化并最終激活下游Caspase-3，Caspase-3特異性酶解與生命活動有關的關鍵酶，級聯“切割”放大，最終阻斷DNA修復酶對DNA損傷修復，引發細胞不可逆性損傷，進而導致凋亡〔16～18〕。本實驗表明利拉魯肽保護胰島β細胞的作用機制是通過提高Bcl-2表達水平、降低Bax及Caspase-3表達水平，從而抑制胰島β細胞凋亡。