系統性硬化癥相關肺動脈高壓兔的目征微循環改變

李倩雨 郭春燕 駱毅 李雪飛 吳銳

(南昌大學第一附屬醫院，江西 南昌 330006)

肺動脈高壓(PAH)是一種慢性進展性疾病，其預后大多不良，嚴重者可導致死亡。根據病因，可以將PAH分為原發性和繼發性，而結締組織病相關性肺動脈高壓(CTD-PAH)是繼發性PAH中的一種，常見的包括系統性紅斑狼瘡相關PAH、系統性硬化癥(SSc)相關PAH和混合性CTD相關PAH。研究顯示其中SSc-PAH是CTD-PAH中腦利鈉肽(BNP)水平最高、肺彌散功能最差、生存率最低的一組，SSc-PAH患者在未經過治療的情況下，其平均生存時間為1年，與原發性PAH相比，其死亡風險增加了3倍〔1～4〕。同時，循證醫學證據表明改善PAH預后的關鍵在于早期發現、早期治療〔5〕。目征微循環是基于中醫目診及目征微循環理論提出的一種血瘀證或血栓前狀態的定量診斷技術，主要觀察內容為球結膜微血管改變，也是全身微循環的一部分。本研究旨通過觀察SSc-PAH兔模型的目征微循環變化特點，為其作為早期預測SSc-PAH的手段提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料 健康雄性新西蘭幼兔30只，體重1.5～2.0 kg，實驗動物由南昌大學醫學院動物實驗中心提供，于實驗前1 w購入實驗動物，飼以兔飼料，自由攝入水分，監測實驗動物的體重變化，實驗過程嚴格遵循單位及國家實驗動物保護與使用的準則。

1.2方法

1.2.1動物分組與處理 將實驗動物按體重隨機分為3組，每組10只，A組為溶劑對照組，采用無水乙醇與生理鹽水2∶8比例混合單次腹腔注射，B組為造模組，采用上述溶劑配成的博來霉素(1 mg/ml)100 μl/d及1.0%野百合堿溶液以50 mg/kg的劑量單次腹腔注射，C組為激素組，在造模同時每晨以甲潑尼龍3.27 mg·kg-1·d-1劑量腹腔注射。各組均飼養3 w造模3 w后觀察各組兔目征微循環變化。

1.2.2主要試劑與儀器 目征微循環儀加裝血瘀證目征軟件(徐州醫學光電公司)；電子天平(舜宇恒平儀器)；快速混勻器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；兔固定器(重慶渝科實驗耗材)；博來霉素(Invitrogen R250-01)；野百合堿(invitrogen)；甲潑尼龍(Pfizer制藥)。

1.2.3肺動脈壓力 造模3 w后，以10%的水合氯醛5 ml/kg腹腔內注射麻醉，麻醉后，取仰臥位固定于手術臺上，前正中切口，切開皮膚、皮下組織及肌肉組織，沿胸骨左側第7肋間剪開肌層，近胸骨處向上剪斷肋骨，取下胸骨，并在兩側縫線牽拉開，暴露心包，于肺主動脈干前壁插入測壓管，監護儀可見肺動脈壓力波形，待波形穩定后記錄數據，以肺動脈壓力上升超過30 mmHg作為PAH造模成功。

1.2.4肺及肺動脈干、皮膚病理 待肺動脈壓力檢測完后，取下肺動脈干及右肺上葉組織，將其置于10%的甲醛溶液中固定，同時以注射博來霉素的部位為中心減去毛發，觀察皮膚的變化，在處死后剪下皮膚組織，同樣置于10%的甲醛溶液中固定，將肺動脈干、右肺上葉及皮膚脫水、石蠟包埋、 切片、HE染色以制作病理標本。

1.2.5右室肥厚指數(RVHI) 取出心臟，減去左右心房，清理周圍血管及結締組織，沿室間隔邊緣剪下右心室游離壁，分離右心室(RV)、左心室(LV)加室間隔(IVS)，在生理鹽水中蕩滌殘留的血塊，清洗干凈后用濾紙吸干、稱重，并計算RVHI。

1.2.6目征微循環觀察方法及評分標準

1.2.6.1觀察方法 于造模前、造模成功后第3周的分別對溶劑對照組、造模組和激素組進行檢測，采用目征微循環儀器改裝成目征診斷儀(586 型號以上電腦，Windows XP 操作平臺、加裝視頻卡、 攝像頭和顯微鏡頭，安裝目征定量診斷軟件)。具體操作： 啟動目征診斷軟件，將兔的編號、分組、體重等信息輸入電腦后，將兔在清醒的狀態下固定于兔固定器內，暴露雙耳及頭部，剪去雙眼的眼瞼睫毛，用眼科開瞼器將上下眼瞼撐開，充分暴露出球結膜血管，用高壓汞燈以45°的角度斜照于球結膜血管部，調整顯微鏡觀察目征微循環狀態，調節攝像頭，使電腦顯示器上同步出現其觀察圖像，并將圖像及資料錄入電腦，其分序號存檔，應用目征微循環診斷法進行診斷。

1.2.6.2評分標準 依據李國賢教授〔6〕提出的目征微循環診斷方法，根據血管扭曲條數、增粗條數、血管瘤、網狀畸形、新鮮出血、陳舊性出血、報傷點、血管色調，并結合眼周皮膚色調進行積分判斷血瘀證及其輕重。

1.3統計學處理 采用 SPSS22.0軟件進行t檢驗及U秩和檢驗。

2 結 果

2.1肺動脈壓力 造模3 w后，存活兔25只，死亡5只，其中溶劑對照組1只，造模組2只，激素組2只。檢測各組肺動脈壓力平均值(mmHg)：溶劑對照組(15.89±2.02)，造模組(38.13±3.14)，激素組(24.5±4.4),3組間兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)，并且造模組均達到30 mmHg以上。

2.2肺及肺動脈干、皮膚病理 造模3 w后肺動脈干、右肺上葉、皮膚病理切片HE染色可見造模組與激素組肺動脈干的內膜和中膜明顯較溶劑對照組增厚，其中以造模組增厚最為明顯；造模組與激素組的右肺上葉小動脈管壁較溶劑對照組也明顯增厚，管腔狹窄，并伴有肺組織的瘀血，且造模組的小動脈管壁厚度比激素組的增厚更加明顯，按照Rabinovitch等〔7〕對PAH進行的病理分級，可以發現激素組的肺組織病理分級多在一期，而造模組多處于二、三期，見圖1。在皮膚病理方面，相較于溶劑對照組，造模組的皮膚真皮和皮下組織膠原纖維增生明顯，真皮層增厚，膠原腫脹、纖維化，彈性纖維破壞，表皮、皮膚附屬器及皮脂腺萎縮，汗腺減少。 造模組的病理符合SSC-PAH的表現，見圖1。

2.3RVHI 溶劑對照組為(0.253±0.008)，造模組為(0.377±0.006)，激素組為(0.311±0.027)，3組間兩兩比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4兔目征微循環改變

2.4.1兔目征微循環總計分改變 根據“目征微循環診斷方法”計算得出目征積分，造模3 w后，計算各組總積分值：溶劑對照組(1.67±2.50)分、造模組(11.25±5.18)分、激素組(5.63±3.20)分，3組之間兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.4.23組亞型目征微循環觀察指標積分比較 在網狀畸形、血管瘤或血管怒張方面，造模組與溶劑對照對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；而激素組與造模組、激素組與溶劑對照組間各亞型的比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

圖1 各組肺組織皮膚組織病理結果(HE，×100)

組別n血管增粗血管扭曲報傷點網狀畸形出血血管瘤或血管怒張血管色調溶劑對照組91.11±2.200.56±1.670.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.00造模組81.88±2.591.86±3.720.00±0.003.13±4.581)0.00±0.003.13±4.581)1.25±2.31激素組81.25±2.311.25±2.310.00±0.001.86±3.720.00±0.001.25±2.310.00±0.00

與溶劑對照組比較：1)P<0.05

2.4.33組亞型目征形態學改變 造模3 w后，造模組及激素組均可見微血管通透性增高，血管邊緣模糊。造模組還可見血管增粗、血管扭曲、網狀畸形、血管瘤及血管色調改變，激素組可見血管增粗、血管扭曲、網狀畸形及血管瘤樣改變(圖2)。

A、B、C為溶劑對照組：正常球結膜微血管形態，未見畸形、出血、擴張；D、E、F為激素組：D可見部分血管怒張，E可見部分血管增粗，F可見部分血管扭曲；G、H、I為造模組：G可見部分血管扭曲，H可見部分血管色調改變，I可見部分血管瘤樣改變圖2 各組亞型目征形態學改變

3 討 論

SSc是一種復雜的自身免疫性疾病，微血管內皮細胞和小血管的纖維增生性病變是其發病機制之一〔8〕。PAH作為SSc最嚴重的并發癥之一，其發生與SSc的微循環血管阻力增加有密切關系〔9〕。 2013年Valeria等〔10〕的研究發現在SSc的患者中甲襞微循環的評分高低與PAH的發生有關，強調了微循環的評估在SSc-PAH中的重要性。 目征微循環相較于甲襞微循環檢測更加不容易受外界環境影響，而且其可肉眼直接觀察進行，方便快捷，屬于無創檢查。既往的研究已經探討了高血壓、糖尿病、慢性乙肝肝炎及系統性紅斑狼瘡血栓前狀態與目征的關系〔11～14〕，發現目征可作為提示2型糖尿病慢性并發癥發生的體征之一、高血壓控制達標及預測靶器官損傷的指標及判斷慢性乙型肝炎血瘀證輕重的有效方法。并且研究發現血管內皮損傷是目征微循環異常改變的關鍵〔15,16〕，其主要機制是：血液流變的異常改變引起了組織缺氧缺血、血管內皮細胞損傷，導致一系列血管異常反應，包括血管強烈收縮、血栓形成、血流瘀滯、血管擴張及血管壁通透性增強、微血管叢增多等，最終引起球結膜微血管形態及色調的改變，例如微血管扭曲、變形、增粗、瘤樣改變、滲出與出血、網狀畸形及色調變暗等。而CTD-PAH的病理生理特點主要包括：①當原發病累及肺組織導致重度間質性肺炎時，肺毛細血管床減少，超過70%時可以出現低氧血癥，引起肺循環阻力增加；②免疫炎性反應導致循環免疫復合物在血管內沉積，導致肺血管炎，使得血管收縮、阻力增加；③內皮系統受損導致內皮素(ET)的合成或釋放增多，導致血管收縮、血栓形成；④血管重構〔17,18〕。本實驗進一步提示微循環改變與SSc-PAH的發病有關，且與SSc-PAH的疾病進展程度呈正相關。