蒙藥乳腺-Ⅰ號對大鼠乳腺增生組織中Prdx-1、GSTP和SOD蛋白表達的影響

王忠超 麻瑩 宋曉環 姚曉媛 朱莉 魏成喜 張彬

(1長春醫學高等專科學校病理教研室，吉林 長春 130031；2吉林大學植物科學學院；3內蒙古民族大學醫學院；4內蒙古民族大學附屬醫院心胸外科)

乳腺增生癥本質是非感染性慢性炎癥及非腫瘤性腫物的病變，目前發病率逐年升高，并趨向年輕化。蒙藥乳腺-I(M-I)號是內蒙古自治區治療乳腺增生癥的傳統秘方〔1〕。通過對M-Ⅰ號處理后的大鼠乳腺組織進行熒光差異雙向凝膠電泳(DIGE)和質譜鑒定，在大鼠乳腺組織中檢測出16種與M-Ⅰ號治療相關的蛋白，其中3種蛋白〔過氧化物酶(Prdx)-1、谷胱甘肽S轉移酶(GSTP)、超氧化物歧化酶(SOD)〕與氧化損傷相關〔2〕。本實驗擬進一步探討M-Ⅰ號對乳腺增生癥的治療機制，為推進蒙藥的開發與利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1動物及主要試劑 雌性未孕Wistar大鼠(體重200～220 g)購自長春市億斯實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK-(吉)2016-0003。苯甲酸雌二醇注射液，購于杭州動物藥品廠；黃體酮注射液，購于浙江仙居制藥股份有限公司；Prdx-1，GSTP,SOD多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG，均購于上海善然生物有限公司。

M-Ⅰ號(哲衛藥準字：9604-79)處方由內蒙古民族大學附屬醫院蒙藥制劑室提供。大鼠給藥劑量根據臨床藥物劑量換算而得。

1.2分組及給藥 雌性未孕Wistar大鼠40只，隨機選出8只作為正常對照組，其余動物每日1次肌肉注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/kg連續25 d，隨后每日1次肌肉注射黃體酮4 mg/kg連續5 d，用于復制大鼠乳腺增生模型；同時，正常對照組大鼠肌肉注射橄欖油。模型復制成功后，隨機分為3組(每組8只)并給予相應處理，模型對照組給予生理鹽水灌胃；M-Ⅰ號低劑量組給予M-Ⅰ號0.5 g/kg，高劑量組給予M-Ⅰ號3.0 g/kg灌胃，期間正常對照組給予生理鹽水灌胃，每天觀察大鼠狀態。給藥4 w后，禁食12 h，取大鼠左側乳腺組織用4%多聚甲醛固定。

1.3大鼠乳腺組織病理學檢查 大鼠乳腺組織進行固定、脫水、石蠟包埋、切片和蘇木素-伊紅染色后在纖維鏡下觀察分析，對大鼠乳腺增生情況分級：輕度增生：小葉內纖維組織增多，腺泡擴張，數量增多，但腺泡及導管上皮無增生；重度增生：不僅腺泡數目增多，且腺泡擴張及分泌現象嚴重，導管上皮出現多層或乳頭狀改變；將正常、輕度、重度增生依次計為1、2、3分，對各組平均積分進行統計。

1.4免疫組織化學方法檢測大鼠乳腺組織中Prdx-1,GSTP,SOD的表達 按照pv-6000通用型二步法檢測試劑盒操作步驟測定：先將組織切片進行脫蠟和水化；3% H2O2去離子水孵育10 min；滴加一抗后室溫孵育2 h，用配好的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次；滴加親和素室溫孵育20 min，PBS沖洗3次；滴加生物素-HRP室溫孵育30 min，PBS沖洗3次；應用二氨基聯苯胺(DAB)溶液顯色；自來水充分沖洗后蘇木素復染。采用Motic Images Advanced3.2軟件分析Prdx-1,GSTP,SOD免疫組織化學圖像中目標總面積占選區總面積的百分比。

1.5統計學分析 采用SPSS11.5軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1M-Ⅰ號對大鼠乳腺組織Prdx-1,GSTP,SOD 表達的影響 與正常對照組比較，模型對照組乳腺組織中Prdx-1和GSTP水平顯著升高(P<0.01或P<0.05)，SOD水平顯著降低(P<0.05)，差異均有統計學意義；與模型對照組大鼠比較，M-Ⅰ號高劑量組Prdx-1、SOD水平明顯降低接近于正常對照組，GSTP水平仍高于正常對照組和模型對照組大鼠。見表1，圖1。

表1 各組乳腺組織Prdx-1,GSTP,SOD表達比較

與正常對照組比較：1)P<0.05,2)P<0.01;與模型對照組比較：3)P<0.05,4)P<0.01

圖1 各組乳腺組織中Prdx-1、GSTP和SOD的表達(HE，×400)

2.2大鼠乳腺組織病理學特征分析 纖維鏡下可見，正常對照組大鼠乳腺小葉呈散在分布，數量無明顯增高，腺泡未見擴張和增多、腺腔內無分泌物或僅有少許分泌物。模型對照組乳腺增生明顯，表現為乳腺小葉數量增多，腺泡及導管大量增生，腺泡高度擴張并且分泌旺盛，導管上皮呈多層和(或)乳頭狀改變。和模型對照組比較，M-Ⅰ號各劑量組乳腺小葉數及腺泡數均少于模型對照組，乳腺腺泡數目及腔內分泌物較少，導管管腔變小，體積縮小；M-Ⅰ號高劑量組中少數大鼠的乳腺結構接近正常大鼠。模型對照組乳腺組織病理學評分〔(2.68±0.31)分〕明顯高于正常對照組〔(1.00±0.00)分，P<0.01〕，M-Ⅰ號低劑量組〔(1.78±0.49)分〕、高劑量組〔(1.24±0.67)分〕的病理學評分顯著低于模型對照組(P<0.05，P<0.01)。

3 討 論

M-Ⅰ號是內蒙古自治區治療乳腺增生癥的傳統秘方，經多年臨床觀察，療效安全可靠，是治療乳腺增生癥的良方〔2〕。本實驗通過復制實驗動物模型證明M-Ⅰ號對大鼠乳腺增生組織有明顯的改善作用，并能夠通過改變Prdx-1、GSTP、SOD 的表達來治療乳腺增生。

Prdx是細胞內存在的一類抗氧化酶，對其認識最初在于它們能催化氧化還原反應使細胞里面過氧化氫水平保持恒定，這對于細胞進行正常活動和功能十分重要〔3〕。越來越多的證據表明，Prdx-1與多種惡性腫瘤的發生發展、侵襲和轉移密切相關〔4〕；但至今為止Prdx-1在乳腺癌中的潛在作用仍然非常模糊。Bajor等〔5〕研究表明Prdx-1可作為人類乳腺癌的生物標志物，Prdx-1下調顯著降低了MCF-7和ZR-75-1乳腺癌細胞的生長速度；當 Prdx-1在乳腺癌組織中高表達時，增加了乳腺癌的惡性程度。O′Leary等〔6〕研究表明，Prdx-1通過其抗氧化功能，可以防止氧化應激引起的ERα損失，從而可能導致乳腺腫瘤的雌激素受體陽性表型的維護。這證實了Prdx-1的生物學活性與乳腺癌雌激素介導信號的調控密切相關。本實驗結果表明，乳腺增生大鼠乳腺組織中 Prdx-1表達明顯增高，M-Ⅰ號治療后Prdx-1表達明顯下降，提示Prdx-1參與了雌激素誘導的大鼠乳腺增生發生過程，而M-Ⅰ號能通過調節Prdx-1的表達改善乳腺增生的病理變化。

GSTP是GSTs蛋白超家族中最重要的亞族，在解毒、抗氧化、抗炎癥等過程中發揮著重要作用〔7，8〕。在本研究中，模型對照組大鼠乳腺組織中GSTP 表達明顯高于正常對照組，當給予M-Ⅰ號治療后GSTP的表達明顯高于模型對照組，推測在大鼠乳腺增生組織中，氧化損傷或毒性物質的作用使GSTP代償性表達增強，而M-Ⅰ號能夠促進GSTP的表達。有研究表明，乳腺癌組織與癌旁組織比較，GSTP的表達明顯減少，主要原因是GSTP基因甲基化發生率升高〔9,10〕。M-Ⅰ號促進GSTP表達的過程是否參與了抑制GSTP基因甲基化的過程，還有待進一步研究。

SOD為自由基清除劑，能有效減輕由于自由基過量引起的脂質過氧化、細胞膜損傷、炎癥、腫瘤等的發生。在本研究中，模型對照組大鼠乳腺組織中SOD表達明顯低于正常對照組，當給予M-Ⅰ號治療后SOD的表達明顯高于模型對照組大鼠，說明M-Ⅰ號能有效增加SOD的表達，通過減少自由基而減少氧化損傷對機體的影響。

綜上，M-Ⅰ號不僅可以明顯改善乳腺增生大鼠乳腺組織結構，還可以通過上調SOD、GSTP的表達、下調Prdx-1的表達而發揮治療作用。