TLR4、MyD88和NF-κB在大腸癌中的表達(dá)及意義

孫振玉 陳學(xué)軍

(錦州醫(yī)科大學(xué)病理教研室，遼寧 錦州 121000)

大腸癌是全世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居全球第三位，每年有超過(guò)一億人被診斷為結(jié)直腸癌，有超過(guò)600 000例患者死于該病〔1〕。在我國(guó)居惡性腫瘤死因的第五位。最近研究發(fā)現(xiàn)致炎因子Toll樣受體(TLR)4和其介導(dǎo)的髓樣合化因子(MyD)88依賴性通路及其下游的一重要因子核因子(NF)-κB，在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。激活TLR4-MyD88-NF-κB信號(hào)通路可啟動(dòng)固有性免疫和獲得性免疫反應(yīng)，并在腫瘤的形成過(guò)程中扮演重要角色。TLR4、MyD88、NF-κB與肺癌、肝癌、卵巢癌等的發(fā)病關(guān)系密切〔2,3〕,但是三者同時(shí)在大腸癌中的檢測(cè)卻鮮有報(bào)道。本文作者通過(guò)檢測(cè)TLR4、MyD88、NF-κB在大腸癌組織、腺瘤組織和相應(yīng)癌旁正常組織中的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機(jī)選取2015年3月至2016年9月錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病例完整的70例大腸癌手術(shù)存檔蠟塊，所有患者經(jīng)術(shù)后病理學(xué)確診為大腸癌，術(shù)前均未接受化療和放療。其中男38例，女32例；年齡41～88(平均63.5)歲；其中高、中分化49例，低分化及未分化21例；70例病例中有28例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；根據(jù)TNM分期，Ⅰ、Ⅱ期42例，Ⅲ、Ⅳ期28例。同時(shí)選取經(jīng)病理學(xué)證實(shí)的36例大腸腺瘤和癌遠(yuǎn)端5 cm正常組織20例。

1.2方法 采用免疫組化PV-6000法，切片經(jīng)脫蠟水化后，微波爐抗原修復(fù)15 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3遍，過(guò)氧化氫(H2O2)室溫封閉15 min，PBS洗3遍，滴加稀釋的一抗：TLR4 1∶100，MyD88 1∶150,NF-κB 1∶300,4℃過(guò)夜。取出PBS洗3遍，滴加二抗，37℃孵育35 min，PBS洗3遍，二氨基甲聯(lián)苯胺(DAB)顯色2～5 min。蘇木素染色、脫水、透明、封片。用已知的陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1TLR4、MyD88和NF-κB在大腸癌組織、腺瘤、癌旁正常組織中的表達(dá) 在70例大腸癌組織中，TLR4、MyD88、NF-κB的表達(dá)陽(yáng)性率均顯著高于腺瘤組織、正常黏膜組織(χ2=34.503，60.457，60.457，均P<0.001)。見(jiàn)表1。TLR4陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)中，在癌旁組織和腺瘤中表達(dá)較少或不表達(dá)；MyD88免疫定位于細(xì)胞質(zhì)中，在癌旁組織和腺瘤中表達(dá)較少或不表達(dá)；NF-κB表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核中，在癌旁正常大腸黏膜組織和腺瘤中表達(dá)較少或不表達(dá)。見(jiàn)圖1。

表1 TLR4、MyD88、NF-κB在大腸癌旁正常黏膜、腺瘤、腺癌中的表達(dá)陽(yáng)性率比較〔n(%)〕

與腺癌組比較：1)P<0.001

圖1 TLR4、MyD88和NF-κB在不同大腸黏膜組織中的陽(yáng)性表達(dá)(DAB，×200)

2.2TLR4、MyD88和NF-κB在不同臨床特征大腸癌組織的陽(yáng)性表達(dá) TLR4、MyD88和NF-κB的陽(yáng)性表達(dá)與大腸癌患者的性別、年齡、腫瘤部位無(wú)關(guān)(P>0.05);與腫瘤細(xì)胞的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 TLR4、MyD88和NF-κB在不同臨床特征大腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)(n)

2.3大腸癌中TLR4及MyD88、 NF-κB蛋白陽(yáng)性表達(dá)的相關(guān)性 TLR4與 MyD88在大腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.474，P<0.05)，TLR4與NF-κB在大腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.435，P<0.05)。

3 討 論

近年來(lái)，TLR4、MyD88及NF-κB在大腸癌中的作用備受關(guān)注，成為研究的熱點(diǎn)。TLR4是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的人類(lèi)Toll樣受體，是Toll樣受體家族的成員之一。1997年Medzhitov等〔4〕首次在人身上發(fā)現(xiàn)與果蠅同源的Toll樣蛋白及其受體，命名為T(mén)LR,現(xiàn)稱(chēng)為T(mén)LR4。人類(lèi)TLR4是Ⅰ型跨膜蛋白識(shí)別受體，可分為胞膜外區(qū)，胞質(zhì)區(qū)和跨膜區(qū)三部分。TLR4在組織中分布比較廣泛，可見(jiàn)于淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、脾細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、小腸上皮細(xì)胞、人子宮平滑肌細(xì)胞、呼吸上皮細(xì)胞〔5〕。TLR4在被活化后，可激活兩條信號(hào)通路：MyD88依賴性途徑和MyD88非依賴性途徑。其中MyD88依賴性途徑又經(jīng)一系列活化，最終激活MAPKs家族(Jun信號(hào)通路及p38信號(hào)通路)和NF-κB信號(hào)通路，其中NF-κB信號(hào)通路，細(xì)胞靜息狀態(tài)下在胞質(zhì)中與抑制蛋白IκB以無(wú)活性三聚體形式存在，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激后IκB發(fā)生磷酸化并降解，NF-κB被釋放進(jìn)入細(xì)胞核啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，并刺激炎癥因子如白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子(TNF)-α的釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)刺激免疫應(yīng)答,同時(shí)釋放的炎癥因子如IL-1、TNF-α等又可以作為激活物激活NF-κB，由此形成反饋機(jī)制周而復(fù)始〔6〕。研究顯示脂多糖(LPS)與TLR4結(jié)合可以使缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)上調(diào)，繼而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移〔7〕。TLR4的激活可以增加前列腺素E2、環(huán)氧化物酶(COX)-2的表達(dá)，增強(qiáng)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)信號(hào)，促進(jìn)炎癥相關(guān)性癌的發(fā)生發(fā)展〔8〕。在APCMin/+的自發(fā)性腸癌的鼠模型提示〔9〕，MyD88信號(hào)通路可促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)及進(jìn)展，對(duì)鼠進(jìn)行皮下腫瘤注射沉默腫瘤細(xì)胞中的TLR4/ MyD88信號(hào)，不僅可以減少腫瘤生成而且可以延長(zhǎng)其生存期。研究顯示在大腸癌中持久性表達(dá)的TLR4可以特異性地激活NF-κB，尤其是在腫瘤起源細(xì)胞，NF-κB通過(guò)炎癥和組織修復(fù)機(jī)制延續(xù)信號(hào)，來(lái)維持腫瘤的生長(zhǎng)及進(jìn)展〔10〕。

本研究結(jié)果顯示TLR4、MyD88及NF-κB在大腸癌中的陽(yáng)性表達(dá)率均比正常組織及腺瘤組織高；且三者之間關(guān)系密切，進(jìn)一步表明其在大腸癌中的相互促進(jìn)作用。Wang等〔11〕檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TLR4、MyD88在大腸癌(CRC)的表達(dá)高于正常黏膜和癌旁組織,高表達(dá)的TLR4、MyD88有利于腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，與腫瘤生長(zhǎng)、侵襲及肝轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。高表達(dá)的TLR4、MyD88及TLR4/MyD88提示患者5年無(wú)病生存期(DFS)和總生存期(OS)均低，提示患者生存期短且預(yù)后不良。還發(fā)現(xiàn)TLR4/MyD88在肝轉(zhuǎn)移的大腸癌患者中高表達(dá)。TLR4、MyD88的高表達(dá)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、增殖，其致癌作用不僅體現(xiàn)在炎癥相關(guān)性大腸癌，在散發(fā)性大腸癌中也扮演重要角色。NF-κB的激活與大腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移擴(kuò)散相關(guān)。Huang等〔12〕通過(guò)組織取樣、大腸癌SW260細(xì)胞系及裸鼠異種移植模型來(lái)檢測(cè)TLR4/NF-κB的表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)NF-κB p65的表達(dá)，在SW260細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)增加了炎性因子IL-6、IL-8的分泌，血清中IL-6、IL-8的水平增高與大腸癌的進(jìn)展關(guān)系密切。本研究結(jié)果與先前的研究結(jié)果基本一致。在本研究中TLR4、MyD88和NF-κB在大腸癌中的表達(dá)均與性別、年齡、腫瘤部位無(wú)關(guān)，而與大腸癌的分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示三者在大腸癌的生長(zhǎng)發(fā)展、侵襲浸潤(rùn)中發(fā)揮重要作用。TLR4、MyD88和NF-κB是腫瘤的早期事件，慢性感染與炎癥是腫瘤形成的重要因素，研究表明大約有15%的大腸患者是由炎性腸病進(jìn)展而來(lái)的，而三者通過(guò)參與免疫反應(yīng)而加強(qiáng)并擴(kuò)大了炎癥效應(yīng)，使其在向腫瘤發(fā)展方向更加推進(jìn)一步〔13〕。但由于TLR4-MyD88-NF-κB在組織中表達(dá)廣泛，涉及信號(hào)通路繁多復(fù)雜，作用正反同存，其具體在組織中與其他因子的協(xié)同作用仍需進(jìn)一步探究，三者在腫瘤標(biāo)志物方面的潛力需進(jìn)一步證實(shí)，相關(guān)抑制劑、治療藥物仍需進(jìn)一步試驗(yàn)。