PI3k/AKT信號通路在老年大鼠乳腺癌血管形成中的作用及對整合素連接激酶ILK的抑制效果

曲義坤 國麟祺 夏偉濱 徐劍

(佳木斯大學附屬第一醫院普外科，黑龍江 佳木斯 154002)

乳腺癌是女性常見的一種惡性腫瘤，患者死亡率較高，近年來臨床上呈現出顯著上升趨勢〔1〕。研究人員發現，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路在腫瘤當中存在失調問題，這一通路的成分突變會影響到通路功能，從而導致細胞的轉化，一方面能夠刺激腫瘤細胞數量的增殖，另一方面還會加速腫瘤細胞的轉移侵襲。所以PI3K/Akt信號通路成為臨床研究的熱點問題，將這一信號通路當作關鍵靶點的乳腺癌靶向治療受到人們的高度重視〔2～4〕。本研究分析老年大鼠乳腺癌血管形成中PI3K/AKT蛋白表達情況對整合素連接激酶(ILK)的抑制效果。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機選擇老年大鼠30只，設為對照組；另外選擇老年大鼠30只，建立老年大鼠乳腺癌動物模型，設為觀察組。入組60只老年大鼠檢疫合格，體重30～68〔平均(45.2±1.3)〕g，12～18周齡，平均(15.1±0.3)w。動物合格證號：SCXK-(吉)2007-0003，所選動物均由醫學動物實驗中心提供SD大鼠常規飼養，自由攝食、飲水，光照12 h，建模前12 h禁食。本研究經過我院動物倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1動物模型建立 30只參與建模的老年大鼠，適應性1 w喂養后，將化學致癌劑二甲基苯蒽(DMBA)10 mg一次性灌胃后第2天開始，按照5 d為1個周期進行干預，連續干預12 w；第1～3天每天腹腔注射苯甲酸雌二醇(北京麥迪海藥業有限責任公司，國藥準字：H200000701)0.5 mg/kg，第4天腹腔注射黃體酮(上海現代制藥股份有限公司，國藥準字H31022328)4 mg/kg，停藥1 d，從而完成老年大鼠卵巢癌動物模型建立。

1.2.2檢查方法 (1)PI3K蛋白表達陽性率。①觀察組建模成功后以斷頸方式處死，取乳腺病灶組織，對照組同樣以斷頸方式處死，常規取乳腺組織。向選取的乳腺組織中加入蒸餾水與濃度為30.0%過氧化氫(H2O2)，常溫下加入內源性酶并進行10 min滅活，磷酸鹽緩沖液(PBS)連續洗滌3次。將最終獲得的切片放置在0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液中，加入生理鹽水控制溶液pH最終為6。電爐加熱直到煮沸，5 min間隔后再次煮沸，常溫下冷卻。采用PBS洗滌2次，每次5 min，最后加入5%胎牛血清(BSA)封閉液并加入兔抗人Ⅱ型膠原蛋白抗體，兔抗人PI3K、Akt蛋白一抗，1滴。滴加完畢后進行3次PBS洗滌；在1 ml底物中加入兔抗人PI3K、Akt蛋白二抗1滴，混合后常溫下顯色，蘇木素復染后封片，倒置顯微鏡下觀察細胞數量，每份標本測定3次，取平均值；②判斷方法。參考奧爾雷德評分標準分別從細胞的陽性數量(陽性細胞數≤25%為0分，26%～50%為1分，51%～75%為2分，>75%為3分)、染色強度(不著色0分，黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分)完成免疫組化染色評分，總分16分，分數越高，陽性率越高。(2)記錄并統計觀察組大鼠病理資料，包括：腫瘤直徑、組織分型、淋巴結轉移情況，分析不同病理資料下PI3K蛋白陽性率。(3)PI3K/Akt信號通路及ILK表達。采用Western印跡法測定軟骨組織中PI3K/Akt信號通路及ILK表達水平。取兩組乳腺組織，放入含有液氮的研磨器中研磨成粉末。向勻漿器中加入RIPA組織裂解液500 μl，待組織充分裂解后移到EP離心管1.5 ml中，10 min離心，離心速度12 000 r/min，離心完畢后留取上清，利用蛋白質定量試劑盒完成蛋白濃度測定并將其放置在-80℃冰箱。精確稱取待測樣品30 μg，加入6倍上樣緩沖液，煮沸5 min使得蛋白充分變性，取上層清液，轉移到EP管中，放入-20℃冰箱中，備用。對蛋白組織進行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳、轉膜后加入兔抗人PI3K/Akt信號通路及ILK一抗，4℃下孵育過夜后進行3次PBS清洗，加入二抗，常溫下1 h振蕩，3次清洗，每次10 min，加入顯色液，在Tanon5200化學發光成像系統中成像。

1.3統計學方法 采用SPSS18.0軟件行χ2及t檢驗。

2 結 果

2.1兩組大鼠PI3K蛋白及Akt蛋白表達陽性率比較 觀察組PI3K蛋白(76.67%)及Akt蛋白(83.33%)表達陽性率顯著高于對照組(16.67%，10.00%，χ2=6.892,P=0.029;χ2=5.718，P=0.031)。

2.2觀察組大鼠不同病理下PI3K蛋白表達陽性率比較 觀察組PI3K蛋白及Akt蛋白表達陽性率與性別無相關性(P>0.05)；觀察組老年乳腺癌大鼠中PI3K蛋白及Akt蛋白表達陽性率在不同腫瘤直徑、組織學分級、淋巴結轉移情況中差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 觀察組大鼠不同病理下PI3K及 Akt蛋白表達陽性率比較(n)

2.3兩組PI3K/Akt信號通路及ILK表達比較 觀察組PI3K/Akt信號表達水平顯著高于對照組(P<0.05)；觀察組乳腺癌大鼠ILK信號表達水平顯著低于對照組(P<0.05)，見圖1。

圖1 兩組PI3K/Akt信號通路及ILK表達

3 討 論

PI3K是生物細胞膜必不可少的組成部分之一，作為轉導分子參與到細胞調節的過程。PI3K對于激活腫瘤細胞的生長及抗凋亡等領域，都有著一定程度的影響〔5〕。PI3K家族的研究較多，根據其結構能夠進一步分成Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅲ型，每型又能夠進一步分成不同亞型。目前，研究最為普遍的是可以被細胞受體激活的PI3KⅠ型，包括ⅠA及ⅠB兩個亞型〔6〕。ⅠA型PI3K是催化亞基P110及P85聯合組成的異二聚體。PI3K能夠同連接蛋白以及生長因子受體互相作用，從而改變二聚體構象將其激活。PI3K還能夠同Ras蛋白及P110的結合，激活結果是在質膜上生成PIP3，PIP3同細胞當中的信號蛋白Akt及磷酸肌醇蛋白激酶(PKD)1進行結合，Akt還可以借助于PKD2(例如ILK)對其磷酸化誘發的Akt徹底活化〔7〕。只有Akt的Thr307及Ser473都徹底磷酸化之后才可以有效發揮功能。Akt是蘇氨酸激酶的一種，包括480個氨基酸殘基，同蛋白激酶(PK)A及PKC高度同源，屬于主要的PI3K下游效應分子〔8〕。Akt分子的氨基酸結果方面主要包括催化結構域、PH結構域及羧基端結構域。其中PH結構域包括氨基酸殘基100個，能夠介導Akt活化之后的膜轉位〔9〕。催化結構域當中包括ATP位點，結構域當中的Thr308的磷酸化是Akt活化必不可少的。目前研究人員發現Akt成員包括Akt1/PKBa、Akt3/PKBg及Akt2/PKBb 3種不同的亞型，包括3種不同的基因編碼，不過蛋白質結構類似，在各種器官組織當中廣泛表達。Akt激活之后，從細胞膜逐漸轉移到細胞核及細胞質，能夠借助于磷酸化抑制或者是激活下游靶蛋白，從而影響到細胞凋亡、增殖或者是遷移〔10〕。PI3K/Akt信號通路受各種因素的影響，負反饋主要由染色體丟失性的蛋白抑癌基因，阻斷Akt及效應分子的活化。本研究結果提示PI3K/Akt同老年大鼠乳腺癌血管生成有重要的影響。檢測乳腺癌組織以及正常乳腺組織當中的PI3K/Akt表達水平，并且分析其同臨床病理指標間的聯系，可以為乳腺癌早診斷以及早治療提供參考依據〔11〕。

PI3K/Akt信號通路的抑制劑能夠在一定程度上抑制VEGF生成與分泌，還能給抑制血管的增殖。PI3K/Akt信號通路可以激活Akt，后者則可以激活底物雷帕霉素靶體蛋白(mTOR)，磷酸化mTOR并且借助于失活結節性復合物2(TSC2)來加速mTOR磷酸化〔12〕。PI3K/Akt信號通路的抑制劑能夠防止因為mTOR抑制而出現的Akt激活，有著重要的應用價值。LY294002及青霉素是常規的PI3K/Akt通路抑制劑，能夠抑制PI3K通路P110亞基活性，從而阻斷信號通路，抑制腫瘤血管增殖及腫瘤生長，不過因為毒性較強而影響到臨床應用〔13〕。雷帕霉素是新出現的一種mTORC1抑制劑，能夠在抑制血管內皮生長因子(VEGF)的過程當中同時抑制血管生成及細胞增殖。同雷帕霉素比較而言，0SI-027及OXA-I能夠發揮雙重抑制效果，所以PI3K/Akt信號通路的抑制劑同VEGF抑制劑聯合使用可以發揮腫瘤血管形成的抑制效果〔14〕。ILK是一個有著3個結構單位的蛋白激酶，并且在N端有著4個重復的錨蛋白序列，接下來是磷酸肌醇基序，C端則是整合素的結合位點〔15〕。ILK活性程度受H3K活性水平的影響，推測其調控作用機制是H3K的生成物PIP3可以借助于磷酸肌醇結合基序來同ILK實現結合〔15〕。活化之后的ILK磷酸化蛋白激酶(pPK)B與糖原合成酶激酶(GSK)3能夠使它們激活同時發揮生物學作用。乳腺癌組織當中的ILK呈現為棕黃色的顆粒，定位在腫瘤的細胞質及細胞膜當中，同時陽性物質集中分布在腫瘤細胞，部分分布在腫瘤問質，間質當中主要是成纖維細胞、巨噬細胞及內皮細胞的著色〔16〕。乳腺癌當中的ILK表達同組織學分級及淋巴結轉移存在顯著相關性。ILK蛋白在乳腺癌組織當中的表達要顯著高于癌前病變組織，表明ILK同乳腺癌病情的發生發展存在不容忽視的重要聯系，可以刺激乳腺癌的轉移以及侵襲〔17〕。ILK在人類的肺癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌及黑色素瘤等組織當中均呈現為高表達，并且表達程度同惡性程度存在顯著正相關〔18〕。ILK高表達細胞在培養過程當中并不貼壁生長，能夠抑制懸浮細胞的凋亡，在裸鼠當中成瘤ILK借助于Ser473來激活PKB，從而影響到細胞的正常死亡〔19〕。PKB抑制細胞的死亡是借助于一系列的效應物實現的，主要包括磷酸化的bcl-2及失活的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)9。借助于過磷酸化還可以抑制forkhead轉錄因子及FAS配體表達。活化之后的PKB磷酸化Ser9能夠抑制GSK3活性程度使得細胞核當中的cyclinD1持續累積，從而刺激細胞周期進行。借助于抑制GSK3活性可以降低13-連接蛋白的降解。GSK3的下游效應物是AP-1轉錄因子的組成元件，GSK3雖然可以對其DNA結構域磷酸化，使其無法順利同DNA進行結合。對GSK3活性程度的抑制影響到磷酸化進程，誘導凋亡蛋白(AP)-1活性。研究人員發現，GSK3活性是細胞及細胞外基質依賴ILK及PI3K來發揮抑制效果的，與此同時，這種抑制對于胞外基質的AP-1活性也有重要的影響〔20〕。細胞及胞外基質之間的互相影響誘導ILK活性，ILK則可以抑制GSK3活性水平。GSK3活性的降低刺激AP-1啟動子序列結合，活化AP-1轉錄因子。本研究結果提示，ILK抑制對于影響老年大鼠乳腺癌血管細胞有顯著的效果。