腺病毒介導hBDNF基因修飾骨髓間充質干細胞靜脈移植對大鼠脊髓損傷后OMgp表達的影響及意義

陳榮生 王長昇 張立群 許衛紅

(福建醫科大學附屬第一醫院脊柱外科，福建 福州 350005)

脊髓損傷(SCI)是一種嚴重的中樞神經系統創傷性疾病，可造成永久性、毀滅性的神經功能缺損和殘疾。骨髓間充質干細胞(BMSCs)是來源于骨髓支持結構的一種多能干細胞，可在體外定向分化為神經元及膠質細胞，用于SCI的移植治療〔1〕，但在神經營養因子與軸突生長抑制因子相互拮抗的局部環境中，神經再生十分有限〔2〕。腦源性神經營養因子(hBDNF)在SCI發生時表達上調，可促進SCI中軸突的再生及感覺功能的恢復〔3，4〕。少突膠質細胞髓鞘糖蛋白(OMgp)是中樞神經系統(CNS)髓鞘中重要的軸突生長抑制因子〔5〕，但目前其在BMSCs治療中的意義尚不明確。本研究通過靜脈移植腺病毒上調hBDNF的BMSCs治療大鼠SCI模型，觀察其療效及對OMgp表達的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物及細胞 雄性SD大鼠(上海斯萊克實驗動物中心)構建SCI模型，體重(250±20)g。人腎上皮細胞系HEK293細胞(上海酶研生物科技有限公司)。

1.2實驗試劑 DMEM培養基、胎牛血清及胰蛋白酶(美國Gibco公司)，脂質體Lipofectamine2000(美國Thermo公司)，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物公司)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國Millipore公司)，蛋白抽提試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)，電化學發光(ECL)發光液(美國Thermo公司)，hBDNF、OMgp及β-actin抗體(美國Abcam公司)，山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(北京中杉公司)，聚丙烯酰胺，SDS及過硫氨酸等(美國Arfleresco公司)，其余試劑均為國產分析純。

1.3實驗儀器 3111型CO2細胞培養箱(美國Thermo公司)，ECO1.5紫外超凈工作臺(美國Thermo公司)，Allegra TM64R高速冷凍離心機(美國Beckman公司)，低溫冰箱(德國Bosch公司)，電泳儀、電泳槽、轉印夾及GelDoc XR凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)，IX70型熒光倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)，DV530紫外分光光度儀(美國Beckman公司)，微量移液器(法國JSON公司)，T100細胞計數儀(美國Bio-Rad公司)，RM6280多道生理信號采集處理系統(成都儀器廠)。

1.4hBDNF基因修飾大鼠BMSCs的獲取及鑒定 提取、分離、培養、擴增并鑒定BMSCs，以hBDNF基因為目的基因，以增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因為標志基因的5型復制缺陷型重組腺病毒載體(Ad5-hBDNF-EGFP)的構建及鑒定，具體操作流程見參考文獻〔6〕，利用脂質體Lipofectamine2000介導骨架質粒pBHGlox-E1-3Cre和穿梭質粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP或EGFP空白載體轉入HEK293細胞中，并收集病毒懸液。取兩組病毒懸液分別以200 MOI濃度感染BMSCs細胞，感染3 d后觀察熒光強度并進行后續實驗。

1.5SCI大鼠模型的構建及分組 將18只SD大鼠隨機分為hBDNF-EGFP-BMSCs靜脈移植組(A組)、空白載體-EGFP-BMSCs靜脈移植組(B組)及損傷對照組(C組)，均采用改良Allen重物打擊法制作T10節段脊髓損傷模型，具體操作方法見參考文獻〔7〕。建模完成3 d后，將hBDNF-EGFP-BMSCs及空白載體-EGFP-BMSCs兩組細胞0.25%胰蛋白酶消化，10%胎牛血清+DMEM重懸終止消化，室溫1 000 r/min離心5 min，1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)洗細胞3次，進行細胞計數，調整細胞濃度為1 × 106個/ml，A、B、C組分別經大鼠尾靜脈注射移植 hBDNF-EGFP-BMSCs、空白載體-EGFP-BMSCs細胞懸液及0.1 mol/L PBS各1 ml。

1.6Western印跡檢測細胞或組織中蛋白表達 細胞總蛋白的收集：將hBDNF-EGFP-BMSCs及空白載體-EGFP-BMSCs細胞培養于25 cm2培養瓶中，待細胞融合度>80%時，0.25%胰蛋白酶消化，10%胎牛血清+DMEM重懸終止消化，4℃ 1 000 r/min離心5 min，1 ml PBS洗細胞3次，200 μl蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑4℃處理細胞1 h，4℃，15 000 r/min離心10 min，取細胞上清液。組織總蛋白的收集：取靜脈移植5 w后大鼠損傷區脊髓40 mg，在液氮中研磨成粉末，200 μl蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑4℃處理細胞1 h，4℃，15 000 r/min離心10 min，收集上清液。BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測總蛋白濃度，取50 μg總蛋白進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，100 V穩壓跑至分離膠底部，將PVDF膜及凝膠固定于轉印夾中，200 mA轉膜2 h，剪取目的條帶，5%脫脂牛奶封閉2 h，將膜與hBDNF(孵育濃度1∶500)、OMgp(孵育濃度1∶500)及β-actin(孵育濃度1∶1 000)抗體4℃脫色搖床孵育過夜，PBS-T洗滌3次，每次10 min，二抗(孵育濃度1∶500)室溫孵育1 h，PBS-T洗滌3次，每次10 min，ECL發光液孵育1 min，GelDoc XR凝膠成像儀進行曝光顯影，目的條帶灰度掃描值與內參基因灰度值比值表示hBDNF及OMgp的相對表達量。

1.7大鼠后肢運動功能檢測 在大鼠靜脈移植后24 h、1、3及5 w，依據參考文獻〔8〕中提出的大鼠SCI后功能評判標準〔脊髓損傷的行為學(BBB)評分〕評價大鼠后肢運動功能的恢復情況，評判時將大鼠置于直徑1 m的平面光滑場地自由活動，觀察并記錄大鼠在5 min內前后肢運動情況，并進行評分。

1.8大鼠皮層體感誘發電位(CSEP)的檢測 在大鼠靜脈移植后24 h、1、3及5 w，10%水合氯醛腹腔麻醉，牙科鉆于冠狀線旁下3 mm處開一直徑為3 mm的圓孔暴露硬腦膜，stoelting腦立體定位儀固定大鼠頭部，將銀球微電極經圓孔接觸硬腦膜，銀針參考電極置于切開皮膚邊緣，刺激電極安放于手術區對側坐骨神經行徑上，行電脈沖刺激，刺激參數：強度7.5 V，頻率50 Hz，波寬0.2 ms的單方波，平均疊加100次；分析參數：時間常數0.02 s，靈敏度200 μV，濾波頻率100 Hz。RM6280多道生理信號采集處理系統行CSEP檢測。

1.9統計學方法 應用SPSS16.0進行t檢驗、方差分析及SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1hBDNF-EGFP-BMSCs及空白載體-EGFP-BMSCs細胞hBDNF及熒光表達情況 hBDNF-EGFP-BMSCs細胞中hBDNF相對表達量(0.516±0.072)顯著高于空白載體-EGFP-BMSCs細胞(0.149±0.030，t=8.150，P<0.001)，兩組細胞均表達較明顯的綠色熒光，見圖1，圖2。

圖1 hBDNF-EGFP-BMSCs及空白載體-EGFP-BMSCs 細胞hBDNF表達情況

圖2 hBDNF-EGFP-BMSCs及空白載體-EGFP-BMSCs 細胞熒光表達情況(×63)

2.2各組不同時期BBB評分比較 3組第3、5周BBB評分差異有統計學意義(F=15.81，17.85；P=0.004 1，0.003 0)，A、B組第3、5周時BBB評分顯著高于C組(q=7.767，5.336；均P<0.05)，第5周A組顯著高于B組(q=3.712，P<0.05)，見表1。

表1 各組不同時期BBB評分比較分,n=6)

與C組比較：1)P<0.05；與B組比較：2)P<0.05；下表同

2.3各組第5周CSEP潛伏期值及峰值比較 3組第5周CSEP潛伏期比較差異有統計學意義(F=21.95，P=0.001 7)，A、B組顯著短于C組(q=9.366,4.901,均P<0.05)，且A組顯著少于B組(q=4.465，P<0.05)；3組第5周峰值差異有統計學意義(F=53.32，P=0.000 2)，A、B組顯著高于C組(q=14.580，6.525；均P<0.05)，且A組顯著高于B組(q=8.052，P<0.05)，見表2。

表2 各組第5周CSEP潛伏期及峰值比較分,n=6)

2.4各組第5周損傷區脊髓組織hBDNF及OMgp表達 3組第5周損傷區脊髓組織hBNF、OMgp表達差異有統計學意義(F=23.52，81.25；P=0.001 4，P<0.000 1)。A組hBDNF表達顯著高于B組及C組(q=8.125，8.650，P<0.05)；A組OMgp表達顯著低于B組及C組(q=8.183，18.000，均P<0.05)，且B組顯著低于C組(q=9.820，P<0.05)，見圖3，表3。

圖3 大鼠第5周損傷區脊髓組織hBDNF及 OMgp表達

組別hBDNF表達(μg)OMgp表達(mg)A組0.631±0.0891)2)0.124±0.0201)2)B組0.318±0.0520.374±0.0451)C組0.293±0.0470.672±0.083

3 討 論

目前SCI的治療主要目標是減少繼發性損傷，改善SCI局部微環境，挽救受損的脊髓神經元；利用各種手段和方法促進神經再生和整合，實現脊髓結構性恢復與功能重建。SCI局部微環境是影響受損神經軸突的再生及功能恢復的重要因素，故目前促進脊髓功能恢復的主要策略包括：①利用神經營養因子促進軸突的存活與再生；②應用下游信號分子促進軸突的再生；③降低神經突觸抑制性分子表達；④BMSCs移植。BMSCs是來源于骨髓支持結構的一種具有多向分化潛能的多能干細胞，具有取材方便，培養簡單，無免疫排斥反應等優勢，因此是SCI細胞替代治療的理想載體〔9，10〕。行BMSCs移植治療后，SCI局部及移植的細胞可以分泌多種神經營養因子，但同時又產生抑制軸突生長的因子，兩種因子的相互對抗，導致了有限的神經再生〔11〕。要進一步促進神經再生，需要額外補充有促進作用的神經營養因子?；蛑委熆蓪⑸窠洜I養因子基因導入體內，通過在局部長期產生神經營養因子提高局部濃度，促進SCI的恢復。hBDNF是一種重要的感覺和運動神經元營養因子，不僅在脊髓的發育過程及維持脊髓正常生理結構和功能中起重要作用，而且在脊髓原發性及繼發性損傷的恢復中也發揮重要作用，是脊髓運動神經元強有力的生存因子，可促進SCI中軸突的再生及感覺功能的恢復〔12，13〕。

本研究結果提示BMSCs移植對于SCI大鼠神經功能修復具有明顯的促進作用，hBDNF的修飾可在BMSCs基礎上進一步促進SCI大鼠神經功能修復，其機制可能與增強神經元生存及促進軸突的再生有關。另外，BMSCs可有效促進大鼠神經電生理的恢復，且經過hBDNF修飾可上調該作用，進一步說明了hBDNF對神經修復的促進作用。OMgp是中樞神經系統白質內多肽合成的特異性糖蛋白，大約只占髓磷脂蛋白0.05%，位于髓鞘及少突膠質細胞的外表面〔14〕，作為中樞神經系統(CNS)髓鞘中的一種重要軸突抑制成分，已經被證明能夠抑制軸突生長，導致生長錐的塌陷〔15〕。本研究結果提示BMSCs本身可能存在某種機制抑制OMgp表達，且hBDNF可協同該機制對OMgp表達的抑制，進而促進神經元生存及軸突再生。綜上所述，經hBDNF修飾的BMSCs可通過抑制OMgp的表達促進SCI大鼠神經功能的恢復，是有效的治療手段。