苦參堿對高頻左心房起搏房顫模型兔的影響

屠葉平 侯月梅 金曉媛 歐陽松 張曉雅

(1上海市奉賢區中心醫院老年科，上海 201499;2南方醫科大學)

心房顫動(房顫)是最常見的心律失常之一，其發生率隨年齡的增長不斷增加。房顫嚴重影響人類健康和生活質量，是持續增長的巨大的社會醫療負擔〔1〕。盡管隨著醫學科技的發展，房顫治療手段也取得較大進步，如射頻消融術、植入式自動復律除顫器等，但藥物仍然是治療房顫的首選〔2〕。傳統的抗房顫藥物在使用時常引起其他類型心律失常的發生。因此，研發更安全有效的抗房顫藥物仍是熱點?？鄥A是從豆科植物苦參中提制而成。近年來，臨床上采用苦參制劑治療快速性心律失常取得了一定療效；在基礎實驗中，也已初步闡明苦參堿有抗心律失常的作用〔3，4〕。但目前為止，鮮見有將苦參堿直接用于抗房顫的基礎研究。微電極陣(MEA)是一種出色的基于生物電生理信號分析的藥物研發檢測工具〔5〕。本文應用MEA技術，在慢性房顫兔模型中，探討苦參堿可能具有的抗房顫作用。

1 材料和方法

1.1實驗動物分組 60只成年新西蘭大白兔，由上海交通大學醫學院實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(滬)2012-0002，不拘雌雄，體重3～4 kg，隨機分成對照組、起搏組、苦參堿A組(5 mg/kg)、苦參堿B組(10 mg/kg)、苦參堿C組(20 mg/kg)，苦參堿D組(40 mg/kg)，每組10只。

1.2主要試劑、設備、儀器 20%烏拉坦溶液，慶大霉素注射液(批號：140237)，苦參堿(批號：1031546)。自制實驗用高頻心臟起搏器，鋼絲電極，德國產光電心電圖機，LEAD-7000電生理儀(四川錦江電子科技)，SA430動物用人工呼吸機(江蘇賽昂斯生物科技有限公司)。64位點EMA系統(德國MCS Gmbh公司)，主要配置為柔性電極(MEA1、MEA2)、MC-Rack軟件包、USB-ME64轉換卡、PGA64 放大器等。

1.3慢性房顫兔模型建立 采用高頻左心房起搏法制作慢性房顫兔模型〔6〕。使用20%烏拉坦按5 ml/kg劑量經兔耳緣靜脈注射麻醉，修剪胸腹部毛發，將兔仰臥位固定在操作臺上，沿胸骨中線開胸，暴露心臟，起搏電極頭端和尾端分別固定于左心房游離壁與胸腹壁，起搏器放置固定于腹壁上，連接各電極線。逐層縫合切口，術后靜脈注射慶大霉素8萬單位預防感染。起搏器模式為AOO，頻率1 000 min-1，電壓6 V，脈寬1.0 ms。起搏組連續刺激3 w；對照組只埋入起搏器，不行高頻左心房起搏。

1.4MEA系統及電信號采集 采用具有64位點的新一代MEA系統，配置的柔性電極包括MEA1和MEA2。原理：柔性電極記錄的原始電信號，通過放大器PGA64增益100倍后，由模數轉換卡USB-ME64數字化，最后使用軟件MC-Rack處理〔7〕。場電位參數：FPmin：第一個負向波峰值，FPmax：最后一個正向波峰值，場電位時限(fAPD)：FPmin到FPmax 的時間〔8〕。興奮傳導速度(CV)=距離÷時間，32電極之間距離固定，興奮的時間差即為興奮傳播所需時間〔9〕。連續起搏3 w后，再次將兔麻醉，仰臥位固定在操作臺上。氣管插管，人工呼吸機輔

助通氣，呼吸機設定為呼吸頻率60次/min，潮氣量55 ml/kg，吸∶呼=1.5∶1。 修剪毛發，經前次手術切口再次開胸暴露心臟，柔性電極MEA1、MEA2同時貼附心房肌，當顯示儀上出現清晰、穩定的場電位圖形時，即為設備連接成功。實驗過程中密切監測呼吸心跳等生命體征。

1.5給藥方法 根據各組預定給藥劑量(5、10、20、40 mg/kg)，將苦參堿經雙蒸水充分溶解，MEA系統電信號采集前半小時經兔耳緣靜脈注射給藥。

1.6統計學處理 采用SPSS23.0軟件。計量資料兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；多組間采用重復測量資料單因素方差分析，方差齊時選用LSD-t，不齊時選用Dunnettt檢驗。

2 結 果

2.1高頻左心房起搏兔房顫模型 連續左心房起搏3 w后，當兔體表常規心電圖示P波消失，R-R間期絕對不規則，出現房顫小f波，頻率至少達450次/min(圖1)，且該特征持續超過20 s，即可認為房顫兔模型制作成功。本實驗房顫兔模型制作成功率為100%。

2.2各組fAPD與CV比較 起搏組與對照組相比，fAPD明顯縮短，CV減慢，差異有統計學意義(P<0.05)?？鄥A各組與起搏組相比，fAPD、CV分別呈濃度依賴性延長與加快，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖2，圖3，表1。

圖1 兔體表Ⅱ導聯心電圖

圖2 對照組、起搏組、苦參堿A組激動傳導圖

圖3 苦參堿B、C、D組激動傳導圖

組別fAPD(ms)CV(m/s)對照組343.75±10.750.44±0.02起搏組256.38±9.421)0.31±0.031)苦參堿A組287.34±10.832)0.34±0.052)苦參堿B組312.63±9.162)0.38±0.042)苦參堿C組338.29±12.442)0.42±0.022)苦參堿D組360.41±13.702)0.47±0.042)

與對照組比較:1)P<0.05;與起搏組比較:2)P<0.05

3 討 論

MEA技術的發明給電生理研究領域帶來了一次重大發展。通過多位點同步記錄神經、心肌等組織的細胞外電活動，擺脫了一直以來只能依靠膜片鉗在單細胞水平對小動物心臟電活動進行研究的限制。由于各電極位點激動的時間差異，可把握激動的傳導方向、傳導途徑，計算出傳導速度〔10〕，由此可作為探討組織細胞群激動傳導異常所致心律失常和抗心律失常機制的依據。將MEA技術作為抗心律失常藥物研發的檢測工具，填補了直觀藥效影響下多細胞外電活動變化的空白。本文在慢性房顫兔模型中，應用MEA技術進行在體動物實驗研究，既能直觀反映苦參對房顫電生理的影響，又能準確體現不同濃度苦參堿之間的作用差異。

心肌電生理改變常引起心律失常的發生，而動作電位又在心肌電生理改變中起重要作用〔11〕。心肌細胞動作電位的變化與多種離子電流有關，動作電位時程(ADP)主要受平臺期(2期)內向Na+、Ca2+和外向K+影響。MEA記錄的局部組織場電位與倒置的單細胞動作電位形態相似，兩者變化具有內在一致性〔12〕。房顫時心肌電生理可發生一系列變化，主要體現在有效不應期和ADP縮短。本文中，起搏組fAPD明顯縮短(即ADP縮短)，符合房顫電生理變化特征，間接驗證了連續高頻左心房起搏可成功誘發房顫。而在苦參堿的干預下，fAPD呈濃度依賴性延長，表明苦參堿可逆轉房顫時電生理變化，起到阻止房顫發生發展的作用，其機制可能與影響Na+、K+、Ca2+等離子多電流運動有關。

研究表明，細胞動作電位上升期瞬態鈉電流(INaT)是影響CV的一個重要因素，其密度下降又是引起房顫的重要機制之一〔13〕。INaT下降導致CV減慢，有利于房顫的發生發展。起搏組CV明顯下降，符合房顫時激動傳導變化特征，但在苦參堿影響下，CV呈濃度依賴性加快。據此可推測苦參堿通過調節INaT密度使CV加快，進而阻止房顫的發生和維持。除了INaT，心房肌縫隙連接蛋白(Cx)40也對CV變化起重要作用。已證實Cx40變異可明顯延緩心房肌動作電位，增加心房肌細胞不均一性，從而促進房顫的產生〔14〕。故苦參堿加快CV也很有可能是因其具有調節Cx40的作用。

綜上，苦參堿具有較好的抗房顫作用，但具體機制并不明確，期待更深入的研究。