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鼻咽癌組織中LMP1和VEGF蛋白的檢測結(jié)果及意義

2019-02-14 09:10:10張逸錚魯明阮神炯鄭朝暉
關(guān)鍵詞:意義血清差異

張逸錚 魯明 阮神炯 鄭朝暉

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)為常見的頭頸部惡性腫瘤,患者大部分來自東南亞地區(qū)以及我國南方地區(qū),福建省是鼻咽癌的高發(fā)區(qū)之一,其病因和EB病毒(epstein-barr virus,EBV)感染、癌基因、抑癌基因結(jié)構(gòu)及功能改變等多種因素密切相關(guān),它的臨床病理特點是低分化性與高轉(zhuǎn)移性,癌癥的侵襲及轉(zhuǎn)移直接影響到該疾病的治療效果。EB病毒感染和鼻咽癌之間的關(guān)系最為密切[1],EB病毒潛伏膜蛋白1(latent membrane protent l,LMP1)是EBV在鼻咽癌細(xì)胞中起到重要作用的癌蛋白[2-3],和鼻咽癌轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系,它通過對多條信號通路進(jìn)行調(diào)控進(jìn)而對鼻咽癌的侵襲以及轉(zhuǎn)移產(chǎn)生不同程度的影響,并可通過活化不同信號通路促進(jìn)腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,一直以來其為各個實驗室分析研究的重點對象,同時發(fā)現(xiàn)LMP1是促進(jìn)鼻咽癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的主要基因之一,對預(yù)測鼻咽癌轉(zhuǎn)移傾向有重要價值[4-5]。VEGF家族的不同成員是調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)因子,其具有控制內(nèi)皮細(xì)胞存活、血管通透性、血管發(fā)生、淋巴血管生成以及血管生成的作用[6]。本次研究主要通過檢測鼻咽癌組織中LMP1蛋白與VEGF蛋白的表達(dá),以及血清中VEGF的表達(dá),以了解鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)等生物學(xué)特性,從而為鼻咽癌的綜合治療以及基因治療提供參考,內(nèi)容如下。

1 資料和方法

1.1 資料

收集福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院2014年1月—2016 年12月經(jīng)病理確診為鼻咽癌和鼻咽部腺樣體切除組織的歸檔石蠟包埋塊,其中鼻咽癌22例,鼻咽腺樣體標(biāo)本14例。將石蠟重新切片HE染色后,再次經(jīng)本院病理科兩位醫(yī)師診斷證實并進(jìn)行病理分型。將收集的組織標(biāo)本分為鼻咽癌組和對照組,再將鼻咽癌組中的組織標(biāo)本分為伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和不伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。詳細(xì)病例數(shù)如下:鼻咽癌組22例,其中男13例,女9例,年齡25~72歲,平均年齡為(45.00±12.92)歲;伴頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織標(biāo)本15例,不伴頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織7例;鼻咽癌組織標(biāo)本病理分型:非角化性癌分化亞型5例,非角化性癌未分化型17例;根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)頭頸腫瘤臨床分期第6版(2002年)對鼻咽癌進(jìn)行TNM分期:Ⅰ/Ⅱ期9例、Ⅲ/Ⅳ期13例;鼻咽炎組14例,其中男7例,女7例,年齡26~58歲,平均年齡為(42.93±12.56)歲。所有患者在收集組織標(biāo)本時均未接受過放療、化療等臨床治療,鼻咽癌患者有無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移根據(jù)患者磁共振(MRI)和CT檢測報告確定,對照組標(biāo)本來源于腺樣體切除后標(biāo)本。本研究經(jīng)過福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會審查通過。

1.2 方法

用免疫組化方法測定LMP1蛋白水平,主要包括石蠟切片預(yù)處理準(zhǔn)備、切片抗原修復(fù)、消除內(nèi)源性過氧化物酶、非特異性封閉、免疫反應(yīng)以及顯色復(fù)染。用酶聯(lián)免疫吸附法測定VEGF蛋白水平,抽取患者4 mL外周靜脈血,在4℃3 000r/min離心10 min,將分離出的血清保存于-70℃中保存,隨后用VEGF-ELISA試劑盒進(jìn)行檢測,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行,顯色后用酶標(biāo)儀比色測定OD值,根據(jù)矯正曲線求出VEGF數(shù)值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,計數(shù)資料用(n,% )描述,組間差異比較采用χ2檢驗,不適用χ2檢驗,則采用Fisher確切概率法;計量資料用(x-±s)表示,采用t檢驗;P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽炎組和鼻咽癌組中LMP1蛋白的表達(dá)

利用免疫組化法檢測對照組和不同淋巴轉(zhuǎn)移分期(不同N分期)的鼻咽癌組中LMP1蛋白的表達(dá)水平。鼻咽癌組中LMP1蛋白表達(dá)的陽性率為68.18% (15/22),在對照組中LMP1蛋白表達(dá)的陽性率 14.29% (2/14);對各組LMP1蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行對比,鼻咽癌組LMP1蛋白的表達(dá)高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

2.2 鼻咽癌伴或不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中LMP1蛋白的表達(dá)

鼻咽癌組中伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LMP1蛋白表達(dá)陽性率為73.33% (11/15),鼻咽癌組中不伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LMP1蛋白表達(dá)陽性率為57.14% (4/7)。鼻咽癌組伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌中LMP1蛋白的表達(dá)水平和不伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌中的表達(dá)水平之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 不同臨床參數(shù)鼻咽癌組中LMP1蛋白的表達(dá)情況

采用Fisher確切概率法分析鼻咽癌各臨床參數(shù)中LMP1蛋白的表達(dá)分布情況,發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌患者性別、年齡、病理分型中LMP1蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在鼻咽癌的TNM分期中LMP1蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表3。

2.4 鼻咽炎組和鼻咽癌組中VEGF蛋白的表達(dá)

VEGF在鼻咽癌組織中陽性表達(dá)率為59.09% (13/22),顯著高于鼻咽炎組7.14% (1/14),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織中VEGF陽性表達(dá)率為73.33% (11/15),無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織中VEGF陽性表達(dá)率為28.57% (2/7),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表4。

2.5 不同臨床參數(shù)鼻咽癌組血清中的VEGF蛋白的表達(dá)情況

ELISA法檢測血清VEGF蛋白水平,結(jié)果表明鼻咽癌患者血清VEGF水平為(468.31±20.23)ng/L,高于對照組(65.13±22.42)ng/L,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=55.906,P<0.001);血清VEGF水平有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者顯著高于無轉(zhuǎn)移者(t=3.708,P<0.001);晚期(III+IV期)患者血清VEGF水平顯著高于早期(I+II期)患者(t=9.556,P=0.038);VEGF水平與患者性別以及年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(性別t=0.093,P=0.927;年齡t=0.828,P=0.418),見表5。

3 討論

在中國,鼻咽癌有非常明顯的區(qū)域分布特征,大部分集中于我國南方五省:廣東、廣西、福建、江西以及湖南省[7],在這些地區(qū),鼻咽癌的發(fā)病率占頭頸部惡性腫瘤之首。近年來,鼻咽癌的發(fā)病率有上升的趨勢,且好發(fā)于鼻咽頂后壁,其次為側(cè)壁。鼻咽癌的發(fā)生主要和三個因素有關(guān),分別是遺傳、環(huán)境以及病毒因素[8]。

表1 鼻咽炎組和鼻咽癌組中LMP1 蛋白的表達(dá)[例(% )]

表2 鼻咽癌伴或不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中LMP1 蛋白的表達(dá)[例(% )]

表3 不同臨床參數(shù)鼻咽癌組中LMP1蛋白的表達(dá)情況[例(% )]

表4 鼻咽癌伴或不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中VEGF蛋白的表達(dá)[例(% )]

表5 不同臨床參數(shù)鼻咽癌組血清中的VEGF蛋白的表達(dá)情況[(x±s)]

研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌在發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的過程中,EB病毒能夠發(fā)揮多種作用,如持續(xù)不斷的表達(dá)癌蛋白,降解細(xì)胞外面的基質(zhì),減少細(xì)胞之間的粘接,在異常細(xì)胞的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮非常關(guān)鍵的作用[9]。這類病毒中最為突出的是LMP1蛋白,其促進(jìn)了腫瘤血管生成并推動了癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散,屬于癌基因的一種。EB病毒是非常常見的皰疹病毒,大部分人都是隱性感染狀態(tài)[10-11]。EB病毒潛伏膜蛋白1(LMP1)是腫瘤壞死因子受體超家族的成員,被認(rèn)為是EBV的主要致瘤蛋白,它是一種整合膜蛋白,它包括CTAR-1、CTAR-2以及CTAR-3三個功能區(qū),三個功能區(qū)利用存在于細(xì)胞膜和高爾基體中的物質(zhì)活化多種信號通路促進(jìn)鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展[12]。LMP1能夠提高鼻咽癌細(xì)胞的運動能力,利用細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)對細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行降解,增大癌細(xì)胞的侵入以及轉(zhuǎn)移能力。本研究應(yīng)用免疫組化檢測鼻咽癌組和對照組中LMP1蛋白表達(dá)水平,鼻咽癌組LMP1 蛋白表達(dá)陽性率明顯高于對照組LMP1 蛋白表達(dá)陽性率,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義。但LMP1蛋白的表達(dá)與年齡、性別、病理分型無明顯相關(guān)性,表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義。通過統(tǒng)計分析比較在鼻咽癌組中伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者LMP1的陽性率和無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者LMP1的陽性率無明顯差異,與龔梁研究結(jié)果不一致,通過對該實驗討論分析,出現(xiàn)該結(jié)果可能有如下原因:本實驗對照組及實驗組樣本數(shù)量偏少,尤其是對照組,而且后期詢問抗體公司發(fā)現(xiàn)抗LMP1單克隆抗體特異性不強,以致對LMP1蛋白在有無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的陽性率產(chǎn)生偏差,但LMP1蛋白表達(dá)陽性率在鼻咽癌組仍大于對照組陽性率,仍具有一定的參考意義。建議后期使用原位雜交技術(shù)來檢測EBV病毒的mRNA更具有代表性。

VEGF是一種有效的血清形成和通透性誘導(dǎo)因子,其在人體的許多正常組織中低水平表達(dá),在多種實體瘤等病理情況下,其表達(dá)異常升高,而且隨著腫瘤惡性程度增加而呈現(xiàn)遞增的趨勢。在本次研究中 VEGF在鼻咽癌組織中陽性表達(dá)率為73.33% (11/15),顯著高于對照組28.57% (2/7),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織中VEGF陽性表達(dá)率為73.33% (11/15),無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織中VEGF陽性表達(dá)率為57.14% (4/7),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);血清VEGF水平有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者顯著高于無轉(zhuǎn)移者(P<0.05);晚期(III+IV期)患者血清VEGF水平顯著高于早期(I+II期)患者(P<0.05);VEGF水平與患者性別以及年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),提示VEGF表達(dá)水平可作為判斷鼻咽癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)。

綜上所述,鼻咽癌是人類一種復(fù)雜的惡性腫瘤,相關(guān)癌基因和相關(guān)抑癌基因的異常參與了鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程。

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