五重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的建立分析

關(guān) 偉

（黑龍江省哈爾濱市阿城區(qū)新利街道辦事處，哈爾濱 150302）

針對(duì)狐貍、水貂、貉子和狗源性成分進(jìn)行具體的分析，并針對(duì)其特異性引物以及探針進(jìn)行相應(yīng)的研究，從而針對(duì)其自身的體質(zhì)來(lái)進(jìn)行相應(yīng)的產(chǎn)品進(jìn)行挑選，為了更好的檢測(cè)狐貍、水貂、貉子和狗針對(duì)熒光PCR 反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件來(lái)進(jìn)行相應(yīng)的篩選，從而更好地突出狐貍、水貂、貉子和狗各自的特異性，選擇與自身屬性相符的產(chǎn)品來(lái)進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。

1 應(yīng)用的材料以及方法

1.1 所需材料

文章中接受檢查的材料都是來(lái)自山東的養(yǎng)殖場(chǎng)的，其中一些動(dòng)物的生肉以及部分五谷都是源于濟(jì)南市的農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，而飼料肉骨粉所需要的一些材料大部分都是從一些生產(chǎn)廠家選取的。

1.2 所需儀器和試劑

針對(duì)動(dòng)物提取組織的試劑盒品牌要進(jìn)行嚴(yán)格的挑選，文章中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)主要使用OMEGA 品牌，一些PCR 反應(yīng)試劑主要從大連的寶生物工程有限公司，引物和探針主要從上海的生工生物工程有限公司進(jìn)行負(fù)責(zé)，針對(duì)動(dòng)物的DNA 測(cè)序主要由山東省農(nóng)學(xué)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心的測(cè)序中心進(jìn)行相關(guān)的負(fù)責(zé)事宜，至于一些熒光定量PCR 儀以及高速離心機(jī)都由相應(yīng)的品牌公司產(chǎn)品進(jìn)行相應(yīng)的負(fù)責(zé)。

1.3 制定的方案

引物與探針的設(shè)計(jì)，通過(guò)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行的rRNA的基因序列進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)查，從而通過(guò)相應(yīng)軟件進(jìn)行同源性的對(duì)比，根據(jù)篩選出來(lái)的核心片段來(lái)進(jìn)行相應(yīng)通用引物的設(shè)計(jì)，從而更好地將引物與探針的特異性展現(xiàn)出來(lái)，通過(guò)不同的發(fā)光基團(tuán)來(lái)進(jìn)行相應(yīng)的修飾，來(lái)清晰實(shí)驗(yàn)效果

針對(duì)陽(yáng)性擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)DNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建，通過(guò)相應(yīng)的DNA 生成工具來(lái)進(jìn)行相應(yīng)的DNA 序列生成，再將其與4種犬科動(dòng)物源性擴(kuò)增引物序列進(jìn)行連接，從而形成新的DNA序列，通過(guò)這些擴(kuò)增的引物序列來(lái)進(jìn)行質(zhì)粒提取，從而針對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)驗(yàn)證，從而達(dá)到結(jié)果與目的的片段得到更好地融合一致；就是針對(duì)樣品的DNA提取，在將樣本充分研磨之后針對(duì)試劑進(jìn)行DNA的提取，提取的方法可以借助儀器動(dòng)物組織提取試劑盒來(lái)進(jìn)行相應(yīng)的提取工程，也可以通過(guò)經(jīng)典手提法來(lái)進(jìn)行相應(yīng)的DNA提取，其中參照了分子克隆手冊(cè)動(dòng)物組織DNA的提取手法，在利用核酸檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)的時(shí)候針對(duì)DNA 的濃度以及OD 值都具備一定的要求；主要是目的基因的擴(kuò)增及標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建，針對(duì)在狐貍、水貂、貉子和狗身上提取的引物進(jìn)行相應(yīng)的PCR 擴(kuò)增，之后再根據(jù)條件進(jìn)行相應(yīng)的步驟，將其動(dòng)物源性PCR 產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收之后可以將這個(gè)轉(zhuǎn)入到感受態(tài)細(xì)胞當(dāng)中進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，隨后挑取單克隆，利用PCR 酶來(lái)對(duì)克隆子進(jìn)行相應(yīng)的性質(zhì)檢測(cè)和驗(yàn)證，從而針對(duì)對(duì)克隆子的測(cè)序來(lái)對(duì)狐貍、水貂、貉子和狗源性成分進(jìn)行相應(yīng)確認(rèn)。

多重?zé)晒釶CR 檢測(cè)方法的建立，通過(guò)針對(duì)動(dòng)物進(jìn)行的熒光定量PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行相應(yīng)的完善，從而更好地建立動(dòng)物相對(duì)獨(dú)立的單重?zé)晒舛縋CR 檢測(cè)方法，在進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測(cè)過(guò)程中要嚴(yán)格的根據(jù)針對(duì)動(dòng)物的特異性以及實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)該注意的事項(xiàng)進(jìn)行相應(yīng)的嚴(yán)格執(zhí)行。在進(jìn)行多重實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)時(shí)需要在單一熒光PCR 建立最優(yōu)體系以及試驗(yàn)特異性及穩(wěn)定性得到相應(yīng)保障的情況下進(jìn)行，才能更好的動(dòng)物的通用引物、特異探針、內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒DNA以及陽(yáng)性內(nèi)標(biāo)探針進(jìn)行相應(yīng)的測(cè)試。再根據(jù)實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。

多重實(shí)時(shí)熒光PCR 特異性測(cè)試，提取從濟(jì)南農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采購(gòu)材料的基因組DNA作為模板，根據(jù)優(yōu)化之后的反應(yīng)體系以及條件來(lái)進(jìn)行相應(yīng)的熒光定量PCR 檢測(cè)其中的引物以及探針特異性。

多重實(shí)時(shí)熒光PCR 靈敏度實(shí)驗(yàn)，利用動(dòng)物組織提取試劑盒來(lái)針對(duì)動(dòng)物的基因組DNA進(jìn)行相應(yīng)的提取，再稀釋到優(yōu)化以后的濃度，從而更好地檢測(cè)動(dòng)物的DNA濃度模板以及靈敏度；主要針對(duì)飼料肉骨粉所需要的材料進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)，從而更好地實(shí)現(xiàn)重新建立的多重實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法以及樣品的價(jià)值。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

針對(duì)實(shí)驗(yàn)可以得知通過(guò)引用單一動(dòng)物PCR 擴(kuò)增結(jié)果及單重?zé)晒釶CR 檢測(cè)方法的建立；針對(duì)多重?zé)晒釶CR 檢測(cè)方法的建立，主要針對(duì)動(dòng)物源性中的引物濃度進(jìn)行相應(yīng)的信號(hào)提示；多重?zé)晒釶CR 特異性實(shí)驗(yàn)，更好地針對(duì)動(dòng)物的引物以及探針進(jìn)行相應(yīng)的特異性檢測(cè)，從而針對(duì)動(dòng)物體內(nèi)的指標(biāo)進(jìn)行熒光檢測(cè)；多重?zé)晒釶CR 靈敏度的實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)提取動(dòng)物DNA來(lái)進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)，從而考查引物以及探針的靈敏度；最后就是針對(duì)樣品的檢測(cè)，通過(guò)針對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)從而有效針對(duì)動(dòng)物源性成分更好地進(jìn)行檢測(cè)。

3 小 結(jié)

近幾年，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)飼料原料以及添加劑受到污染的情況，從而導(dǎo)致動(dòng)物自身也受到一定的影響，威脅到了人們自身的權(quán)益，所以人們針對(duì)飼料以及肉骨粉來(lái)進(jìn)行了嚴(yán)格的監(jiān)督，同時(shí)也通過(guò)研究來(lái)針對(duì)動(dòng)物自身進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)，從而達(dá)到動(dòng)物更加健康的生長(zhǎng)，間接減少社會(huì)危機(jī)問(wèn)題的浮現(xiàn)。