凋亡相關蛋白、信號通路在腎小管上皮細胞凋亡中的作用機制研究進展

王城，何平，彭沁雪

(中國醫科大學附屬盛京醫院南湖院區，沈陽110004)

自從Kerr等[1]根據細胞發生了和壞死完全不同的過程而提出凋亡這個概念以來，凋亡開始成為醫學領域的研究熱點。按照細胞死亡命名委員會(NCCD)最新的定義[2]，凋亡分為內源性凋亡和外源性凋亡。這基本對應了兩條經典的凋亡途徑，即內源性途徑(也稱為線粒體途徑)和外源性途徑(也稱為死亡受體途徑)。在病理生理條件下，不管是腎小管局部的缺血、缺氧、尿蛋白超載、藥物毒性作用，還是全身系統的高血糖、高尿酸，甚至病毒感染等，均可作為直接或間接因素誘導腎小管上皮細胞凋亡，進而引起急性腎損傷或慢性腎臟疾病[3～5]。但是，腎小管上皮細胞凋亡的分子機制仍未明確。目前文獻報道其相關凋亡蛋白主要有Bcl-2蛋白家族、死亡受體半胱氨酸蛋白酶(caspase)，凋亡相關信號通路主要有絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路、酪氨酸激酶(JAK)-轉導和轉錄激活因子(STAT)信號通路、3-磷酸肌醇激酶(PI3K)-絲氨酸/蘇氨酸激酶 (Akt)信號通路等。為了解腎小管上皮細胞凋亡機制，本研究對以上蛋白及信號通路在腎小管上皮細胞凋亡中的作用進展作以下綜述。

1 細胞凋亡概念、分類

傳統形態學意義上的凋亡具有細胞皺縮、核固縮、核碎裂、質膜空泡以及凋亡小體(apoptotic bodies)形成等特點，隨著生物化學試驗技術以及基因檢測技術的發展，將細胞死亡按照形態學分類已經無法適應層出不窮的新發現，故而2012年開始NCCD,在可測量的生化特點的基礎上將死亡形式進行了新的分類,凋亡被分為內源性凋亡和外源性凋亡，還進一步將內源性凋亡分為caspase依賴性和非依賴性凋亡，這一定程度上是因為凋亡誘導因子(AIF)可以誘導凋亡而不依賴caspase。然而，事實上有研究團隊[6]發現AIF以及EndoG是以一種caspase依賴的方式參與凋亡過程的。另一方面，隨著研究進一步深入，科學家們發現AIF更多地參與了聚腺苷二磷酸核糖聚合酶依賴性細胞死亡等新的細胞死亡形式。從2015年開始，NCCD將凋亡定義為一種caspase依賴的調控性細胞死亡方式。需要注意的是，程序性細胞死亡不同于調控性細胞死亡，也不完全等同于凋亡。程序性細胞死亡特指調控性細胞死亡中參與生物發育及維持機體穩態的部分，在形態學上既可以表現為凋亡的特點，也可以表現為其他形式。內源性凋亡以線粒體外膜透化(MOMP)形成為特點，主要是由各種各樣的微環境改變引發的，包括但不限于生長因子分泌不足、DNA損傷、內質網應激、活性氧超載等[2]，Bcl-2蛋白家族是主要調控因子。失巢凋亡是內源性凋亡的一種特殊形式[2]，腎小管上皮細胞中也發現了這種凋亡[7]。外源性凋亡是由細胞外微環境改變引起的，主要由兩種質膜受體驅使，即死亡受體和依賴性受體，后者在腎小管上皮細胞凋亡中鮮有報道。內源性途徑和外源性途徑最終走向一條共同途徑或稱之為凋亡執行階段,該階段涉及到一系列caspase的激活。caspase-3的激活是內源性凋亡和外源性凋亡的共同特征，有了caspase-3的激活凋亡才得以繼續進行[2]。需要注意的是，兩條凋亡途徑不是單純線性獨立存在的。在外源性途徑中，caspase-8的激活可以引起BID的激活，后者可以通過寡聚化Bax和Bak從而使內源性凋亡繼續進行[8]。線粒體是參與上述凋亡途徑的主要細胞器，但內質網、溶酶體、細胞核等也參與了細胞凋亡[9]。

2 凋亡相關蛋白、信號通路在腎小管上皮細胞凋亡中的作用機制

腎小管上皮細胞凋亡的分子機制十分復雜，其凋亡途徑主要有內源性凋亡途徑、外源性凋亡途徑以及凋亡共同途徑，其主要相關凋亡蛋白有Bcl-2蛋白家族、死亡受體、caspase。此外，MAPK、JAK-STAT、PI3K-Akt等多種信號通路也參與其中。研究凋亡相關蛋白及信號通路中的一系列分子有助于了解腎小管上皮細胞凋亡機制。

2.1 凋亡相關蛋白在腎小管上皮細胞凋亡中的作用機制

2.1.1 Bcl-2蛋白家族 Bcl-2蛋白家族是內源性凋亡的主要調控因子,通常分為兩大類。第一大類為抗凋亡蛋白(例如Bcl-2、Bcl-XL、MCL1等)，它們均包含4個不同的BH同源結構域，可以通過拮抗促凋亡蛋白發揮抗凋亡作用。第二大類為促凋亡蛋白，既包括Bax和Bak這些同樣含有四個BH同源結構域的蛋白，也包括BH3-only蛋白(例如tBID、BAD、PUMA)，僅含有1個BH3結構域。目前認為，BH3-only可以通過直接與Bax和Bak結合使其發生一系列構象改變，使其寡聚化，進而形成MOMP，MOMP形成后，線粒體通透性增加，細胞色素C釋放到胞質中去,進一步形成“凋亡體”，最終激活caspase-3引起細胞凋亡[2]。最近的一項研究[4]發現，在近端小管上皮細胞中，高糖可以通過上調凋亡調節蛋白的表達誘導凋亡。在腎小管上皮細胞中，Bax和Bak是增加線粒體通透性的主要調控者，而Bcl-2和Bcl-XL可以通過增強線粒體外膜的穩定性拮抗它們的效應[10]。Bax/Bcl-2是評估凋亡的良好指標，被廣泛應用在腎小管上皮細胞凋亡研究中[11,12]。近來有學者[13]通過免疫組化的方法，發現Bax/Bcl-2指標的變化還可以作為狼瘡腎炎患者疾病進展的一項監測指標。促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的失衡決定了凋亡是否發生，但它們之間不是簡單的“敵進我退”關系，Bax/Bcl-2增高時，既可以有Bax表達增加，也可以有Bcl-2表達增加。

2.1.2 死亡受體 死亡受體是腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族的一部分，常見的有TNFR1、FAS、TRAILR1等，它們通過和相應配體結合，促進或抑制凋亡的信號傳導。死亡受體途徑引起凋亡的信號傳導方式大同小異。例如，FasL和Fas結合成為牢固的三聚體，使其位于細胞內的尾部結構發生構象改變，從而使它的死亡結構域能夠和銜接蛋白Fas相關死亡結構域(FADD)的死亡結構域結合，FADD反過來可以通過它的死亡效應區募集procaspase-8、細胞FLICE抑制蛋白(c-FLIP)等形成所謂的死亡誘導信號復合體(DISC)[2]。c-FLIP是一類抗凋亡蛋白，參與構成死亡誘導信號復合體，短鏈的c-FLIP蛋白表達增加可以抑制FAS介導的細胞死亡，可能是通過與procaspase-8形成無活性的異源二聚體實現的[14]。盡管死亡受體途徑本身有套路，但其上游信號通路卻是復雜的。Wang等[15]發現，腎臟缺血再灌注使沉默信息調節因子2(SIR2)活化，活化的SIR2可以讓轉錄因子FOXO3a去乙酰化，進而促進其表達增加并轉移到細胞核，最終通過增強FasL的表達引起腎小管上皮細胞凋亡。最新的一項研究[5]表明，乙型肝炎病毒X蛋白與炎癥因子通過協同作用顯著增強TRAIL介導的腎小管上皮細胞凋亡，是通過NF-κB激活后上調DR4表達實現的。

2.1.3 caspase caspase激活貫穿外源性途徑和內源性途徑，caspase-3的激活是內源性凋亡和外源性凋亡的共同特征。caspase是一組半胱氨酸蛋白酶，目前為止共有13種在人類中被證實，通常認為和凋亡相關的有(caspase-2，-3，-6，-7，-8，-9，-10)。根據caspase在凋亡過程中發揮的作用，可以將上述幾個蛋白分為起始者和執行者,前者以caspase-9和caspase-8為代表，后者以caspase-3為代表。MOMP形成后，原本位于線粒體膜間隙的細胞色素C釋放到胞質中去,和凋亡蛋白酶活化因子、caspase-9前體共同形成“凋亡體”,活化caspase-9，再激活執行者caspase-3而引起細胞凋亡[2]。實驗[16]表明，食品添加劑對氨基苯胂酸(俗稱阿散酸)可以通過激活caspase-9和caspase-3途徑導致腎小管上皮細胞凋亡，這可能是其引起腎毒性的機制。XIAP是另一種抗凋亡蛋白，系人類凋亡抑制蛋白家族(IAP)的重要一員，IAP中只有它可以通過和caspase緊密結合從而根本上阻斷其酶鏈反應[2]。在所謂的“Ⅱ型細胞”中，caspase-3和caspase-7被高表達的XIAP抑制，外源性凋亡需要通過caspase-8水解BID以激發內源性凋亡途徑來保證凋亡的發生[2,17]。多個研究[17,18]證實，腎小管上皮細胞屬于“Ⅱ型細胞”,例如，Kirstin等在實驗中證實FasL促進了procaspase-8、FLIP、BID的表達。反過來，在IAP拮抗劑存在的條件下，FasL仍然能夠以caspase-8途徑發生。事實上，MOMP除了可以引起細胞色素C的釋放，還能引起半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶激活劑(SMAC/DIABLO)釋放到胞質中。SMAC是一種天然的XIAP拮抗劑。實驗[19]表明，熱休克蛋白72可以通過抑制SMAC釋放并增強XIAP穩定性減少腎小管上皮細胞凋亡。總之，caspase是腎小管上皮細胞凋亡機制的核心內容，通過和SMAC、XIAP等凋亡調節蛋白相互制衡巧妙而精細地控制凋亡的發生、發展。

2.2 凋亡相關信號通路在腎小管上皮細胞凋亡中的作用機制

2.2.1 MAPK信號通路 MAPK是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可以將細胞的胞外信號呈遞給細胞核，通過調控相關基因廣泛參與炎癥、細胞分化、細胞增殖、細胞死亡等。在哺乳動物細胞中已知至少3種MAPK信號通路，包括細胞外信號轉導信號激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38激酶(p38MAPK)，它們均參與了腎小管上皮細胞凋亡[10,20]。腎小管上皮細胞凋亡與急性腎損傷及腎臟纖維化關系是目前的研究熱點，但具體的分子機制仍有待進一步研究。研究[12]表明，中草藥提取物大黃素可通過抗氧化作用降低MAPK磷酸化水平來減輕腎小管上皮細胞凋亡，起到保護腎臟的作用。但另一項研究[21]表明，低溫誘導的ERK磷酸化可減少腎小管上皮細胞凋亡，有助于減輕缺血再灌注損傷造成的腎臟損害。Wu等[22]發現，在糖尿病小鼠模型中，加入c-Scr抑制劑后，腎小管上皮細胞凋亡減輕，可能是通過抑制p38MAPK信號通路實現的。一項新近的研究[23]表明，在狼瘡腎炎小鼠模型中，miR-485可作用于p38MAPK信號通路的上游分子RhoA，通過RhoA介導的TGF-β-MAPK 信號通路調控腎小管上皮細胞凋亡。JNK活化后既可以通過激活FasL促進腎小管上皮細胞凋亡[15]，也可以通過增加細胞色素C的釋放促進腎小管上皮細胞凋亡[20]。還有研究[10]表明，在缺氧條件下，二苯基氯化碘鹽可通過ERK信號通路上調Bcl-2的表達而阻斷腎小管上皮細胞凋亡。綜上，MAPK信號通路廣泛參與腎小管上皮細胞凋亡，但在具體作用靶點的細節問題上仍有待進一步研究。

2.2.2 JAK-STAT信號通路 JAK/STAT信號通路廣泛參與細胞活動，如細胞增生、分化、凋亡及免疫應答等，其上游分子包括各種細胞因子和生長因子。細胞因子或生長因子和相應的受體結合后，可以激活JAK，進而使STAT形成二聚體，轉移到細胞核內，調控下游基因的表達。目前發現，哺乳動物細胞中JAK激酶主要有4種，STAT家族共有7種，其中與腎臟疾病最相關的是JAK2和STAT3。He等[24]發現，乙型肝炎病毒HBx蛋白可以通過激活JAK2/STAT3信號通路引起腎小管上皮細胞凋亡，這可能是乙肝病毒相關腎病的發病機制之一。Erkasap等[25]發現，單獨應用白藜蘆醇后，短時間內可觀察到TNF-α水平升高，導致STAT-1和STAT-3表達增加。如果將白藜蘆醇和瘦素聯合應用，則可以降低TNF-α水平，可觀察到腎小管上皮細胞凋亡減輕。一項最新的研究[3]表明，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)激動劑AICAR 通過抑制JAK2/STAT1途徑減輕順鉑造成的急性腎損傷。但也有學者[26]發現，白細胞介素-22可以使磷酸化的STAT3水平增加，發揮抗凋亡作用，減輕小鼠缺血再灌注損傷導致的腎損害。這提示JAK/STAT信號異常激活才會引起腎小管上皮細胞凋亡。

2.2.3 PI3K-Akt信號通路 Akt(又稱作蛋白激酶 B 或 PKB)是一種原癌基因，它在調控各種不同細胞功能(包括代謝、生長、增殖、存活、轉錄以及蛋白質合成)方面發揮重要作用，已經成為醫學界關注熱點之一。PI3K是一種胞內磷脂酰肌醇激酶，其活化后的產物磷脂酰肌醇3, 4, 5-三磷酸(PIP3)可作為第二信使激活Akt和其他下游因子。研究表明，PI3K-Akt信號通路在腎小管上皮細胞發揮抗凋亡作用。糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)是PI3K-Akt信號通路的一個下游分子，它的Tyr216殘基被磷酸化后其活性被激活，Ser9殘基被磷酸化后其活性被抑制。GSK-3β活性增加后，可能是通過抑癌基因p53介導腎小管上皮細胞凋亡。Long等[27]發現，用沖擊波處理腎小管細胞后，可觀察到自噬現象發生，被磷酸化的Akt及GSK-3β(ser9)明顯增加；而敲除自噬相關基因后，Akt/GSK-3β途徑被抑制，細胞凋亡也增加，提示在某些病理條件下，自噬現象可以通過Akt/GSK-3β途徑減少凋亡，發揮細胞保護作用。

綜上所述，凋亡是細胞在內外微環境改變時，以caspase激活為主要特征，多種途徑、多個細胞器共同參與的一種調控性細胞死亡。腎小管上皮細胞凋亡機制是精細而復雜的，涉及到多種蛋白如Bcl-2蛋白家族、死亡受體、caspase及多條信號通路如MAPK、JAK-STAT、PI3K-Akt等的激活，各種蛋白及信號通路間相互作用，共同決定凋亡發生與否,這有利于維持腎小管的動態平衡，但也為相關的科學研究帶來巨大困難。探究腎小管上皮細胞凋亡的分子機制，進而研究可以通過該機制減輕凋亡的基因或藥物，可能為臨床治療腎臟疾病帶來新的突破。