miRNA與腎纖維化關系的研究進展

郭雪梅，張詩琬，喻雪琴，敬雪明

(川北醫學院附屬醫院，四川南充637000)

我國成年人慢性腎臟病患病率約為10.8%,其中多數患者發展為終末期腎衰竭，基本病理變化為腎纖維化。研究發現,人體至少有1 000種miRNA并調控人類60%的基因[1]，miRNA通過抑制基因轉錄或沉默相應mRNA調控特定靶基因表達，對細胞活化、增殖和凋亡發揮調節作用，miRNA表達異常將致細胞功能受損和腎纖維化、腫瘤、糖尿病等發生。研究顯示，部分特定miRNA可多途徑調控腎纖維化的發生發展。轉錄生長因子-β(TGF-β)/Smads是促腎纖維化發生的最主要信號通路，miRNA通過對靶基因調節，可雙向作用于TGF-β/Smads等信號通路對腎纖維化形成發揮調控作用。研究發現，腎纖維化患者和腎纖維化大鼠模型腎組織及外周血中部分miRNA表達失常并與腎纖維化關系密切。miRNA的發現為診斷、治療及評估腎纖維化提供了新思路。現就miRNA在腎纖維化中機制的研究進展進行綜述。

1 miRNA的生物學特征

miRNA lin-4是Lee等[2]在1993年發現的一種小分子非編碼RNA。miRNA含有18～25個核苷酸，表達于機體各個組織和器官，具有高度保守性、組織時序性，可調節多種細胞的表觀遺傳；同時miRNA也具有顯著的組織特異性，不同組織器官中miRNA水平表達差異明顯。研究發現，miR-21、miR-192、miR-200家族等在腎纖維化組織中呈特異性高表達并參與了腎纖維化的發生發展過程。其可能路徑是：首先核內特定基因或編碼蛋白質基因被RNA聚合酶Ⅱ轉錄為雙鏈pri-mRNA，然后pri-mRNA在胞核內被轉錄為含70個核苷酸的雙鏈pre-mRNA；隨后pre-mRNA從胞核內進入胞質中，接著被裂解為含22個核苷酸的雙鏈miRNA；最后雙鏈miRNA經過選擇與RNA誘導的沉默復合物形成miRNA誘導的沉默復合物并在底物作用下發揮調節功能。

靶mRNA的3′UTR序列在與miRNA特異性地結合后發揮對基因表達的調控作用， miRNA對轉錄后基因水平表達起負性調節作用，參與細胞活化、增殖、轉化、凋亡及脂質代謝等過程，與腎纖維化、腫瘤、糖尿病等疾病的發生發展相關。miRNA在腎纖維化患者中還參與了血壓穩定和電解質平衡調節，通過誘導腎素高表達使腎小球旁細胞切酶失活調節腎纖維化的發生。miRNA在機體血清、尿液、唾液及其他體液中可檢出并穩定表達，其表達水平與疾病間存在一定相關性，可作為疾病早期診斷的生物標志物和治療的潛在靶點。

miRNA通過誘導作用，促進其參與形成的微小RNA誘導的基因沉默復合體(miRISC)識別并結合于靶mRNA的3’端非轉錄區，再通過序列互補機制對靶基因表達進行負性調控。若miRNA與靶mRNA間互補完全，靶mRNA被miRISC直接裂解；若與靶mRNA部分互補，miRISC則對基因轉錄發揮抑制作用。但研究發現[3]，在細胞靜息狀態時，miRNA-369-3可誘導miRISC中的FXPL蛋白和AG02蛋白與靶mRNA結合而促進活化對靶mRNA發揮轉錄作用，推測miRNA在細胞不同狀態下對靶細胞的調節作用不同。

2 miRNA與腎纖維化

腎臟肌成纖維細胞(MF-HSC)是形成細胞外基質(ECM)的最主要來源細胞，MF-HSC來源于纖維細胞、外膜細胞、血管周圍細胞及間充質細胞等。同時，miRNA、結締組織生長因子(CTGF)、TGF-β也可與相應受體作用后直接或間接地活化相應信號通路促腎纖維化發生，而子宮敏感性相關基因(USAG)和BMP-7可抑制腎纖維化的發生與進程。miRNA通過對TGF-β/Smad等信號通路活化促進間充質細胞轉化(EMT)為MF-HSC。在腎纖維化形成過程中，miRNA直接或通過對信號通路調節等多途徑、多交叉參與腎纖維化的發生。

2.1 miRNA在腎臟中的表達 首先，部分miRNA在腎臟中出現不同的特異性表達。如miR-192、miR-215、miR-146a等在腎組織中高表達且遠高于其他組織，其中miR-192d等在腎皮質中的表達水平是腎髓質的20倍；另外，腎組織中的miR-21、miR-130、miR-200a等均出現不同水平表達[4]。其次，腎纖維化信號通路中的相關靶基因與miRNA表達譜相關[5]。如miR-21、miR-29等特定基因對炎性細胞浸潤、細胞因子表達異常、細胞增殖分化凋亡、ECM形成與降解失常等腎纖維化形成相關環節產生調控作用。

2.2 miRNA對ECM形成的影響 ECM的過度沉積是腎纖維化形成的根本特征，其保持ECM形成與降解的動態平衡是維持腎組織結構穩定的重要因素，腎纖維化是ECM形成大于降解而導致ECM過度沉積的結果。ECM的形成受兩種蛋白級聯調節：一是基質金屬蛋白酶(MMPs)和基質金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)，另外是絲氨酸蛋白酶纖溶酶原激活物(tPA)和纖溶酶原激活物抑制因子(PALs)，二者間的平衡狀態對ECM的形成影響較大。

2.2.1 miRNA對ECM形成的促進作用 目前miRNA對腎纖維化影響主要集中在ECM形成與降解失衡方面，并通過miR-21、miR-29、miR-192等參與ECM水平調節，但miRNA對ECM的調節受多因素、多路徑影響。研究發現，miR-29s能與ColⅠ、ColⅢ、ColⅣ mRNA的3′UTR結合來抑制蛋白質轉錄下調纖維膠原蛋白水平而發揮抗腎纖維化作用。Wang等[6]研究發現，在腎纖維化小鼠腎組織中miR-21高表達并與TIMP-1正相關，與MMP-9負相關，推測miR-21可調節MMP-9/TIMP-1失衡狀態而參與腎纖維化形成。在對糖尿病與非糖尿病腎纖維化大鼠模型研究發現，miR-21對PI3K-PTEN信號通路發揮抑制作用，促進Ⅰ型膠原蛋白高表達而促進ECM形成[7]。miR-21有促進腎纖維化形成的作用。在腎小管上皮細胞中，TGF-β可通過Smad 3促進miR-21高表達，高表達的miR-21又可促進TGF-β表達來誘導膠原纖維蛋白-Ⅰ和a-SMA高表達而致ECM形成；同時，沉默miR-21后膠原纖維蛋白-Ⅰ和a-SMA低表達，抑制ECM形成。大鼠單側輸尿管結扎后發現其腎組織中miR-21水平與腎纖維化程度正相關[8]。用TGF-β處理糖尿病小鼠腎小球與體外小鼠系模細胞后，miR-192、膠原纖維蛋白-Ⅰ、a-SMA水平上調，ECM形成增加，從而促進腎纖維化發生。在糖尿病小鼠腎臟中，下調miR-192水平可降低膠原纖維蛋白-Ⅰ、a-SMA、TGF-β水平而抑制ECM形成。小鼠系膜細胞研究發現[9]，miRNA-let7b通過對Col1a2、Col4a1的直接作用，促進糖尿病腎病腎組織中膠原纖維高表達而促進ECM形成。miR-132可誘導腎血管周圍細胞向MF-HSC轉化增殖而促進ECM形成，推測沉默miR-132可能為抗腎纖維化治療的新靶點。

2.2.2 miRNA對ECM形成的抑制作用 miRNA除了具有促進ECM形成的作用外,miRNA也具有抗腎纖維化作用。miR-29可抑制TGF-β與下游靶基因CTGF結合,抑制ECM形成并促進ECM降解而緩解腎纖維化程度。研究發現，在腎近端小管細胞系NRK52E中Smad 7高表達， miR-21、miR-192下調，miR-29b高表達，抑制ECM形成。沉默Smad 7后，腎組織中miR-192和miR-21高表達，miR-29b低表達，促進ECM形成，小鼠腎纖維化程度加重。TGF-β通過激活下游信號分子Smad 2、Smad 3，誘導miR-21高表達，抑制miR-29、miR-200表達而降低ECM形成[10]。miR-21可直接下調TGF-β/Smads信號通路中的Smad 7水平，促進α-SMA和ECM高表達，誘發和促進腎纖維化發生[11]；miRNA-let7b 可靶向抑制TGF-β而降低Smad 3活性，抑制TGF-β表達水平、降低ECM形成而發揮抗腎纖維化作用[12]。

2.2.3 miRNA對炎性細胞因子水平的調節 研究發現，在TGF-β誘導下,miR-21能促進ECM形成和α-SMA高表達。在成纖維細胞中,ERK/MAP激酶信號活化可能是miR-21促進腎纖維化形成機制之一，沉默或下調miR-21水平可抑制嚙齒動物腎纖維化模型的腎纖維化程度和減輕腎組織炎癥程度[13]。沉默miR-21的腎組織中, 脂類代謝、脂肪酸氧化還原能力增強與miR-21水平負相關,顯示miR-21可通過調節代謝途徑來調控腎纖維化發生[14]。敲除miR-21的質粒轉種到梗阻性腎病后，其腎纖維化程度降低，顯示調節miR-21水平可能是抗腎纖維化治療的新途徑[15]。miR-21在腎細胞中高表達可促進腎組織炎癥發生,沉默miR-21后腎組織炎癥減輕和巨噬細胞浸潤減少[16],這可能與抑制miR-21后促炎細胞程序性細胞死亡-4(PDCD4)低表達抑制巨噬細胞浸潤相關。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)可通過上調TGF-β表達誘導EMT并促進腎纖維化發生。NRK52E在AngⅡ誘導下miR-29b低表達并抑制細胞中TGF-β高表達，miR-29b 通過抑制AngⅡ間接抑制TGF-β/Smads通路降低ECM形成。研究發現，AngⅡ誘導下的小鼠腎小球中miR-30s低表達，miR-30s高表達時可抑制AngⅡ水平而緩解腎小球炎癥。

2.3 miRNA對EMT的影響 腎纖維化發生的主要效應細胞是成纖維細胞。在病理狀態下，成纖維細胞的活化、增殖致ECM形成而發生腎纖維化。目前對于成纖維細胞來源有不同觀點，多數學者認為其主要來源于活化的間質成纖維細胞、腎小管上皮細胞、腎小球內皮細胞等。在miRNA表達譜中，miR-21可正向調控TGF-β促進ECM形成，但miR-21需在TGF-β活化后才能發揮作用。腎組織中高表達的miR-29b可抑制TGF-β誘導膠原纖維和ECM形成[17]。miR-155 需與特異靶點RhoA結合參與TGF-β/Smad對EMT調控，沉默正常小鼠乳腺上皮細胞中miR-155后可抑制TGF-β誘導EMT發生[18]。低氧狀態可誘導腎上皮HK-2細胞miR-155高表達并伴隨α-SMA、TGF-β水平上調[19]，顯示miRNA可能在調節EMT進程中發揮調節作用。

3 miRNA對調控腎纖維化信號通路的影響

目前，TGF-β/Smads信號通路是公認的最主要致腎纖維化發生的通路[20]。TGF-β作為最重要的促腎纖維化因子，通過誘導腎小球系膜細胞增殖、MF-HSC活化與增殖以及EMT、ECM形成等途徑來促進腎纖維化發生[21]。TGF-β受體效應蛋白Smad(2、3、4、7)在腎纖維化中發揮了調控作用。Smad 2、Smad 3在腎纖維化患者和腎纖維化小鼠組織中高表達；Smad 4處于TGF-β/Smads信號通路的關鍵位置，發揮抗炎、抗腎纖維化作用；Smad 7為TGF-β負反饋調控因子，與Smad 2、Smad 3競爭結合活化TβR-Ⅰ而抑制TGF-β/Smads活性。

3.1 miRNA與TGF-β/Smads信號通路調節對腎纖維化的影響 腎纖維化的主要特征是成纖維細胞活化和ECM過度沉積，其中TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin等多信號通路參與了腎纖維化形成[22]。TGF-β有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三個亞型，TGF-β1豐度最高、活性最強。激活的TGF-β1與TβR-Ⅱ結合后活化TβR-Ⅰ并磷酸化下游的Smad 2/3基因，磷酸化的Smad 2、 Smad 3解離與Smad 4融合成異源二聚體并進入胞核而調節靶基因轉錄，Smad 7為一種抑制性Smad，能使TβRI和Smads發生裂解而對TGF-β/Smad通路進行負調控[23]。TGF-β通過誘導ECM形成、抑制MMPs并誘導TIMPs表達而抑制ECM降解、參與EMT而誘導MF-HSC形成、誘導成纖維細胞活化等機制來促進腎纖維化形成，在腎纖維化形成過程中TGF-β始終處于高表達狀態[24]。

3.2 miRNA與TGF-β/Smads信號通路在腎纖維化發生中的作用 目前，miRNA如何通過調節TGF-β/Smads信號通路來調控腎纖維化的機制還不清楚。研究發現，miRNA與TGF-β/Smad信號通路間的調節是相互的，miRNA通過誘導TGF-β信號通路活化促進TGF-β高表達而致腎纖維化的發生。腎纖維化患者中，TGF-β通過Smad 3促進miR-21、miR-192高表達, miR-29低表達，抑制腎小管內皮細胞Smad 7表達。Smad的抑制劑Smad 7可維持miR-29b功能，抑制miR-21，miR-192表達，防止腎纖維化發生。腎組織炎癥時，TGF-β誘導miR-21高表達并抑制Smad 7表達，增強TGF-β信號通路活性，促進ECM形成而致腎纖維化發生。在成纖維細胞中，miR-21可增強TGF-β/Smad通路活性促進TGF-β的致腎纖維化作用,但同時也存miRNA對TGF-β表達的負性調控作用。研究發現，miR-196a/b在沉默TGF-β/Smad 信號通路后，膠原纖維蛋白-Ⅰ和a-SMA水平低表達，ECM低表達而腎纖維化程度減輕。在大鼠腎纖維化模型中，miR-133在與CTGF 結合后，通過抑制TGF-β/Smad路徑來降低腎纖維化形成。通過轉染miR-26a人足細胞的體外培養發現，CTGF 水平下調明顯，miR-26a直接抑制CTGF表達而抑制TGF-β/Smads通路活性來抑制ECM形成。

3.3 miRNA對Wnt/β-catenin信號通路調控腎臟纖維化的影響 Wnt/β-catenin為一種高度保守而能調節細胞增殖、器官發育、組織損傷和修復的信號通路，其在正常腎組織中不表達，在腎組織損傷或炎癥大鼠腎模型及人腎功能失調時被活化。研究發現，Wnt/β-catenin與腎纖維化發生和進展關系密切并促進了血纖維蛋白酶原激活物抑制因子-1以及MMP-7等多種促/抑纖維基因表達。血管緊張素可直接作用于下游Wnt/β-catenin通路促進腎纖維化的發生，抑制Wnt/β-catenin傳導通路可在大鼠腎纖維化模型中減輕腎損傷和纖維化形成與程度，抑制Wnt/β-catenin通路可能成為腎纖維化治療的潛在靶點[25]。

總之，miRNA與腎纖維化間關系密切，miRNA具有組織特異性和對靶基因調控的專一性，特定miRNA有望成為抗腎纖維化治療的潛在靶點。但是，腎纖維化的發生受多因素影響，miRNA與促/抗纖維化因子間關系復雜，目前也只發現了少數特定miRNA在腎纖維化中的初步作用機制，主要集中在TGF-β/Smad信號通路上，且研究結果也存在差異。因此，miRNA在腎纖維化中的確切作用機制及其抗腎纖維化治療新靶點的應用還需要進行深入研究。