差異蛋白質組學在神經系統疾病生物標志物篩選中的研究進展

安東,袁正偉

(1中國醫科大學附屬第一醫院，沈陽110001；2中國醫科大學附屬盛京醫院衛生部小兒先天畸形重點實驗室)

蛋白質組學是在大規模水平上對某一特定細胞、組織、體液中所有蛋白質進行研究的學科?；蚪M學、蛋白質組學、代謝組學分別從基因、蛋白質和代謝產物角度研究，共同構成現代生物研究的重要手段，為生命科學的發展提供了廣闊前景[1]。差異蛋白質組學是蛋白質組學研究的主要策略之一，借助該技術可以篩選出不同因素引起的樣本之間的差異蛋白質譜，同時獲得對某些關鍵蛋白的認識和功能分析。作為研究生命現象的手段和方法，差異蛋白質組學技術對發現疾病診斷標志物、研究疾病發病機制、尋找新的靶向治療藥物有重要的應用價值。神經系統是人體非常復雜的器官系統，神經系統的疾病種類多樣，臨床表現各異，病因復雜，發病機理不清，診斷和治療都面臨巨大挑戰。差異蛋白質組學技術能從眾多復雜的基因和蛋白質中篩選出一組改變明顯的關鍵性分子，找到疾病發生、發展的候選標志物?，F就差異蛋白質組學研究的主要技術手段以及該技術在神經系統領域的差異蛋白質組學分析研究綜述如下。

1 差異蛋白質組學技術

1.1 基于雙向凝膠電泳(2-DE)定量技術 傳統2-DE技術其原理是根據等電點和分子量兩個方面將蛋白質進行分離。隨著技術進展，出現了熒光差異凝膠電泳(DIGE)。DIGE的技術原理是將熒光染色技術與雙向電泳技術相結合，首先對測試樣品用不同熒光染料標記，然后將混合樣品在同一塊凝膠上進行雙向電泳，使測試樣品的蛋白質在同一平面顯示不同的熒光，從而區分蛋白質點不同熒光的差異，實現蛋白質的相對定量。該方法與傳統的2-DE相比有助于完全二維分析和量化，克服了其重復性差的問題。但DIGE只適用于標記含有賴氨酸的蛋白，否則將使用特殊熒光染料，費用較為昂貴。

1.2 基于液相色譜串聯質譜技術(LC-MS/MS)定量技術 目前基于LC-MS/MS定量技術飛速發展，已經成為蛋白質組學研究的主要分析手段，其靈敏度更高、檢測范圍更大，且檢測速度快、自動化程度高，可以實現蛋白質組學研究高通量、高深度的要求。其方法進一步分為兩種:非標記定量技術和穩定同位素標記定量技術。

1.2.1 非標記定量技術 非標記定量通過比較樣品中蛋白質酶解后多肽的質譜分析次數或質譜峰強度進行定量分析。該技術包括兩種定量方法?；诙壸V圖的非標記定量技術利用蛋白肽段匹配的二級譜圖計數實現蛋白定量，基于一級質譜的非標記定量是比較一級譜圖中的質譜峰面積強度或離子信號強度進行相對定量。非標記定量所需樣品制備簡單、無需標記、試驗速度快、成本較低。近年來，基于一級質譜的蛋白質非標記定量技術隨著配套數據處理軟件和程序不斷開發，該技術得到了較廣泛的應用。但是在高豐度蛋白存在時,譜圖數可能達到飽和造成結果不準確，且只依據一級質譜和數據模型定量，準確率不高，且重現性差[2]。

1.2.2 穩定同位素標記定量技術 是向測試樣品中引入穩定同位素標記，通過比較不同同位素標記物的質譜信號強度實現不同樣品中蛋白質的相對定量分析。穩定同位素標記方法與相對非標記定量相比，定量更為準確，重復性好。根據同位素標記引入方式的不同，分為體內標記和體外標記兩類。細胞培養中穩定同位素標記氨基酸(SILAC)是經典的體內標記定量技術，其原理是利用輕、重同位素標記的必需氨基酸培養細胞，細胞經過若干次傳代，細胞內新合成蛋白質被同位素穩定標記，然后將樣品混合，根據兩種不同同位素標記肽段的面積或峰強度比實現對蛋白質的相對定量。SILAC技術可以把時間維度與定量蛋白質組學相結合，從而對蛋白質組動態變化進行研究。體外化學標記常用方法主要有基于一級質譜的同位素親和標簽(ICAT)技術、基于串聯質譜的等重同位素標記相對和絕對定量(iTRAQ)技術和串聯質量標簽(TMT)技術等。ICAT技術通過特異性結合半胱氨酸琉基的ICAT試劑來標記肽段，而后進行分離純化和質譜鑒定，根據一級質譜圖中標記肽段的面積比實現相對豐度的定量。該技術可以簡便、快速、準確比較樣品中球蛋白的表達。基于串聯質譜的iTRAQ標記技術是目前差異蛋白質組學研究中應用最廣的技術，所采用的標本來源廣泛，可將腦組織、腦脊液、血漿、細胞、體液等各種樣品中的蛋白質經胰蛋白酶酶切為多肽后用iTRAQ標記，通過比較第二級質譜中不同樣品的報告離子峰強度進行相對定量分析。具有靈敏度高、標記效率高、蛋白質覆蓋率高，數據豐富，定量準確、可信度高、重復性好等優點[3]。通過在樣本中加入已知量的經iTRAQ標記的標準品做內標，還可進行蛋白質的絕對定量?；趇TRAQ技術的差異蛋白組學研究方法已成為發現疾病生物標志物的主要分析手段。TMT試劑與iTRAQ 試劑的原理類似，可以對2組、6組、10組樣品同時進行標記。目前TMT 試劑在蛋白質組學研究中應用日趨增長，該定量技術還可以通過與高分辨質譜技術和其他標記技術相結合，實現更高通量、更深精度的蛋白質組學定量分析[4]。

2 差異蛋白質組學技術在神經系統疾病生物標志物篩選中的應用

生物標志物作為機體在疾病狀態下的分子信號，可以呈現為體液中的循環物質，也可以定位于細胞內部，是診斷、監測疾病、評估治療和判斷預后的重要標志。利用差異蛋白質組學可以在組織或體液中進行定性、定量研究,高通量篩查出系列特異生物分子。這些生物標志物可以應用于神經系統腫瘤、神經退行性疾病、神經缺血損傷、神經發育畸形的診斷及治療。

2.1 神經系統腫瘤 確診中樞神經系統腫瘤通常需要活檢，基于蛋白質組學技術尋找血漿標志物作為一種非侵入性的診斷手段成為現今的研究熱點。目前對神經系統腫瘤(如多形性膠質細胞瘤、星形細胞瘤)蛋白和基因的表達已有很多研究。Miyauchi等[5]用SWATH 質譜技術分析比較了膠質瘤患者與正常人群血漿差異蛋白，結果發現LRG1、C9、CRP、GSN、IGHA1、APOA4具有較好的診斷價值，并且發現LRG1、CRP、C9與腫瘤大小呈明顯正相關。Petushkova等[6]利用蛋白翻譯后修飾組學研究發現了膠質母細胞瘤患者血漿乙?；头核鼗揎椀漠惓！olisetty等[7]應用高分辨質譜技術分析了彌漫性星形膠質細胞瘤的差異膜蛋白組，與已報道的轉錄組數據比對，發現190種差異蛋白在兩組不同組學數據中表達趨勢一致。在新近研究中，Spreafico等[8]用腦脊液蛋白質組鑒定了兒童腦腫瘤擴散轉移的預測標記物，其中驗證了6種蛋白(1型膠原、胰島素樣結合蛋白4、前膠原 C-肽鏈內切酶增強子1、神經膠質細胞系衍生神經營養因子受體α2、胰蛋白酶α抑制劑重鏈4、神經增殖和分化控制蛋白-1)在腫瘤轉移病例組與對照組有顯著差異。2017年Gu等[9]比較了來源于Ⅳ期髓母細胞瘤患兒的原發腫瘤和轉移腫瘤細胞系的差異蛋白，結果發現1 400種顯著變化的差異蛋白，這些差異蛋白包括一些已知的對腫瘤轉移有促進或抑制作用的蛋白，同時也發現了大量未知作用的蛋白，此為將來進一步研究髓母細胞瘤轉移標記物提供了線索。

2.2 神經退行性疾病 神經退行性疾病發病率近年有明顯的上升趨勢，由于其發病機制尚不清楚，治療也缺乏有效方法和手段。由于腦脊液與腦組織中細胞外液直接相連，中樞神經系統發生病變時，會影響腦脊液中的組成成分，因此檢測腦脊液蛋白質組學對中樞神經疾病的診斷、治療和預后判定具有重要意義。腦脊液蛋白質組學的研究代表了對中樞神經系統生理及病理變化認識層次的深入。Abdi等[10]利用iTRAQ 標記技術通過腦脊液蛋白質組學研究了神經退行性疾病阿爾茨海默病(AD)、帕金森病和路易體癡呆征患者腦脊液中蛋白質表達的差異，檢測鑒定出1 500多種蛋白質，發現了大量的差異蛋白，驗證結果顯示多種標志蛋白質聯用可以提高診斷的特異性和敏感性。Sathe 等[11]應用高分辨質譜及TMT標記定量蛋白質組技術發現了AD患者腦脊液中139種差異蛋白，其中NPTX2聯合PKM或YWHAG具有較好的診斷敏感性和特異性，這些差異蛋白質有可能成為AD病情進展及治療的反應性監測指標。

2.3 顱腦缺血損傷 顱腦損傷其病程進展及預后往往難以預測，對其進行準確的早期診斷面臨巨大的挑戰，且目前尚無有效的治療方法。鈣結合蛋白S100B蛋白最近被確定為腦損傷診斷及預后的標志物[12]。使用定量基于MS 蛋白質組學方法，Hanrieder 等[13]發現重型顱腦損傷后急性期反應物水平升高，包括纖維蛋白原、神經元特異烯醇化酶、膠質纖維酸性蛋白和胱抑素C，而腦脊液中S100B 無變化。Bao等[14]收集重度腦損傷患者慢性意識障礙病程不同時間段及健康人群血漿，對血漿樣本進行iTRAQ 標記和分析，在顱腦損傷后鑒定出32種蛋白質有顯著差異改變，并且這些差異蛋白主要參與補體系統通路。

2.4 神經發育畸形 神經管畸形(NTD)是兒童常見嚴重的神經系統先天畸形，發病率為1‰～5‰。該病由環境因素和遺傳因素共同作用所致，其畸形的發病機制并不清楚，治療效果不佳。Fan[15]等用雙向電泳和質譜分析的方法對先天性脊柱裂胎鼠的脊髓組織進行了蛋白質表達譜的分析，鑒定出14種差異蛋白。Shan等[16]利用該方法結果在羊水中鑒定出7種差異蛋白質。Liu等[17]利用表面增強激光解析/離子化飛行時間質譜篩選神經管缺陷胎兒母親血清、尿液和羊水中差異蛋白，并結合分類與回歸分析建立診斷模型，診斷神經管缺陷胎兒的靈敏度和特異度較高。An等[18]用iTRAQ結合質譜技術比較了NTD及正常妊娠孕鼠血清中差異蛋白，分別在致畸早期2個時間點鑒定得到40種和26種差異表達蛋白質，并且在孕婦血清中擴大樣本驗證PCSK9作為NTD產前診斷標志物具有較好的敏感性和特異性。Shen等[19]用MALDI-TOF-MS 技術比較了NTD妊娠與正常妊娠孕婦血清蛋白質的差異表達，經蛋白質指紋圖譜軟件發現3種蛋白診斷NTD的敏感性和特異性可達到96%和90%。

3 未來展望

近年來，蛋白質組學方法在神經系統疾病研究領域取得了長足的發展，神經系統疾病生物靶標的研究成為當今熱點。未來我們期待在疾病早期就可以發現用于臨床的以非侵入性檢查獲得的新的分子標志物，從而及早發現神經系統疾病。非侵入的生物靶標主要在體液中尋找，如血漿、尿液和腦脊液等，而腦脊液和大腦直接接觸，因此腦脊液蛋白質組學對神經系統疾病的研究有很大價值。然而由于體液中含有大量的高豐度蛋白，難以鑒定出低豐度蛋白，因此發展對低豐度蛋白的富集技術，以便鑒定出更多的有價值的分子標志物至關重要。而實現生物靶標的臨床應用還需要遵循蛋白質組學臨床指南在多中心進行大樣本的生物驗證研究。