豬繁殖與呼吸綜合征的研究進展

劉 賀，金 暉，陳 晨，姚鵬杰，祁思霖

（1.撫順市動物疫病預防控制中心，遼寧 撫順 113006；2.遼寧省動物及產(chǎn)品檢疫中心，沈陽 110115；3.朝陽市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，遼寧 朝陽 122000）

豬繁殖和呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的豬RNA病毒病，該病以流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和病弱仔豬，仔豬產(chǎn)出后因呼吸道疾病和繼發(fā)感染常常很快死亡為特征。1987年在美國首先發(fā)現(xiàn)本病[1]。由于病原不明確，便稱為豬神秘病（SMD），另有藍耳病、藍色流產(chǎn)、豬不孕與呼吸綜合征（SIRS）等名稱[2]。現(xiàn)在已經(jīng)在大多數(shù)歐洲國家及部分亞洲國家發(fā)現(xiàn)，我國在1996年首先由郭寶清報告本病[3]。其造成豬的繁殖與呼吸障礙，給國內(nèi)的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失，嚴重威脅我國的動物衛(wèi)生安全，對本病開展研究具有重要的現(xiàn)實意義。

1 病原學

PRRSV屬于套式病毒目，動脈炎病毒科，動脈炎病毒屬[4]。該病毒是一種直徑50～70 nm有囊膜的正鏈RNA病毒，基因組序列已經(jīng)明確。對豬的肺泡巨噬細胞具有高度嗜性。PRRSV可分為2個亞群，即歐洲型（A亞群）和美洲型（B亞群）。由于PRRS的基因突變、病毒基因重組及連續(xù)的基因異變，加之病毒株之間的競爭和免疫壓力選擇，PRRSV存在較大的基因變異，個別分離株的毒力、抗原性差異較大。我國發(fā)生的PRRS，經(jīng)全序列測序表明是美洲型。PRRSV對寒冷具有較強的抵抗力，對高溫和化學藥品的抵抗力較弱。病毒在-70℃可保存18個月，4℃可保存1個月，37℃48 h，56℃45 min完全失去感染力，對乙醚和氯仿敏感。

2 臨床癥狀及病理變化

本病自然感染潛伏期一般為14 d。臨床表現(xiàn)為：母豬病初精神倦怠、厭食、發(fā)燒，妊娠中、后期發(fā)生早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、弱胎、產(chǎn)奶量下降、不發(fā)情或?qū)遗洳辉小８腥咀胸i以2～28日齡的癥狀最為明顯，死亡率常達80%。早產(chǎn)仔豬多數(shù)24 h內(nèi)死亡，多表現(xiàn)為腹瀉、呼吸困難、肌肉震顫、后肢麻痹、打噴嚏、嗜睡、耳朵發(fā)紺。剖檢常見淋巴結(jié)不同程度出血和壞死變化，肺臟病變初間質(zhì)增寬呈水腫狀、之后出現(xiàn)瘀斑和實變，肝臟淤血、變性、腫大，脾臟腫大、出血性梗死，腎臟腫大、變性。育肥豬臨床癥狀不明顯，主要病變?yōu)殚g質(zhì)性肺炎。

近年來，本病發(fā)生后常繼發(fā)或并發(fā)一些病毒病或細菌病。趙國明等發(fā)現(xiàn)，PRRS可與豬偽狂犬病（PR）混合感染[5]。湯景元等從某規(guī)模化養(yǎng)殖場送檢的3頭患病仔豬分離出了PRRSV和致病性沙門氏菌[6]。母安雄等根據(jù)豬群發(fā)病情況、臨床癥狀、剖檢和實驗室檢查確診為豬流感并發(fā)PRRS[7]。陳紹柏也曾報道過豬藍耳病（PRRS）與豬瘟混合感染[8]。

3 實驗室診斷

獸醫(yī)工作者和科研人員在原有的診斷方法的基礎上開發(fā)了很多的新的PRRSV的診斷技術，對PRRS的預防和及時治療具有重大的意義。

3.1 血清學檢驗法

3.1.1 免疫過氧化物酶單層細胞實驗

免疫過氧化物酶單層細胞試驗是目前常用的檢驗血清中PRRS抗體的方法。微量滴定板加巨噬細胞，5%CO237℃孵育18～24 h，將含105TCID50（半數(shù)組織培養(yǎng)感染量）·mL-1的病毒懸液50μL加入每孔，5%CO237℃孵育18～24 h，棄去培養(yǎng)液，用鹽水沖洗培養(yǎng)板，置37℃干燥45 min后-20℃冷凍45 min。玻片上黏附的細胞用含4%多聚甲醛PBS處理，室溫放置10 min，鹽水沖洗。加入1∶10稀釋的被檢血清（稀釋用含4%馬血清和0.5%吐溫-80的0.2 M NaCl），37℃孵育1 h，沖洗。加入兔抗豬HRPO結(jié)合物50μL，封板37℃孵育1 h。顯色液/底物（AEC）染色鏡檢，血清內(nèi)存在抗體，則巨噬細胞胞質(zhì)被染成深紅色[9]。

3.1.2 酶聯(lián)免疫吸附實驗

有研究報道，用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）取代IPMA，該方法敏感性、特異性和符合率均高于IPMA。法國已將ELISA作為檢測和診斷本病的常規(guī)方法。徐引弟等采用IDEXX公司生產(chǎn)的ELISA試劑盒對湖北、湖南、福建、浙江等省的大中型豬場豬生殖與呼吸綜合征（PRRS）的流行情況進行了血清學檢查，都檢查出了很高的陽性率[10]。目前開發(fā)的試劑盒采用的歐洲型或美洲型病毒，或者采用這兩種抗原，具有迅速處理大批血清樣品的特點。

3.1.3 間接熒光抗體實驗

盡管現(xiàn)在無一個標準的公認的免疫熒光檢測方法，但在北美洲的實驗室研發(fā)出若干方案并已被采用。1～10周齡仔豬感染后7 d產(chǎn)生抗體，8 d IFA 滴度在 1∶20～1∶320，4周均為陽性，滴度＞1∶2 560，而且大部分豬的抗體滴度至少為1∶1 280。尹訓南等用IFA對人工接種PRRSV的8頭30日齡豬進行體內(nèi)定位檢測，結(jié)果表明，特異性熒光細胞出現(xiàn)的頻度、數(shù)量及熒光度以肺臟最為明顯，特異性熒光主要出現(xiàn)在巨嗜細胞及血管內(nèi)皮細胞的胞漿中。值得關注的是，不同實驗室IFA判斷標準會有不同，在一定程度上檢測結(jié)果判定取決于所用的毒株。

3.2 PCR檢測方法

3.2.1 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測法

有研究用RT-PCR建立一種直接檢測PRRS病毒的方法。以RT-PCR法擴增從西班牙分離的7株病毒的312 bp片段，進行克隆和測序，有96%～97%序列與PRRSV的核甘酸序列相同。有研究用PCR法能檢測出在細胞培養(yǎng)物中，或精液中30個感染單位（TCID）的PRRS病毒。Guarino等根據(jù)美洲株的（ATCCVR-2332）的ORFs4、6、7和Lelystad毒株的ORF1b設計了6對引物，對來自美洲的24個PRRS病毒進行了RT-PCR的擴增，其中保守性強的ORF7基因檢出率為100%。Madsen等用RT-PCR方法對分離自丹麥某豬場的血清進行檢測，通過對病毒核甘酸序列ORF2-ORF7的分析發(fā)現(xiàn)，其序列與VR-2332序列的同源性為99.2%～99.5%，從而判定此株病毒是PRRSV的一種變異株[11]。徐宜強等參考國內(nèi)外已發(fā)表PRRSV的基因序列及相關的RT-PCR檢測方法報道，根據(jù)PRRSV高度保守、高特異性的NP蛋白基因設計了一對引物，建立了PRRSV RT-PCR檢測方法[12]。

3.2.2 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導恒等溫擴增實驗

LAMP是由Notomi等發(fā)明的一種用于病毒檢測的核酸擴增技術，因其敏感、高效和便捷，被應用到很多常見疫病的檢測[13]。鄧顯文等利用NSP2基因的RT-LAMP檢測方法，敏感性高于常規(guī)PCR10倍[14]。曾少靈等構(gòu)建的美洲型PRRSV及其高致病性變異株RT-LAMP檢測方法應用檢測58份病料，其結(jié)果與實時熒光RT-PCR方法檢測符合率100%[15]。該方法操作簡單且易于判定，適合基層和現(xiàn)場開展檢測，但是其氣溶膠污染值需高度關注，應做好檢測環(huán)境分區(qū)和定期通風，避免假陽性出現(xiàn)。

3.2.3 數(shù)字PCR

數(shù)字PCR是基于單分子PCR方法來進行計數(shù)的核酸定量，不依賴Ct值或內(nèi)參基因，即可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數(shù)目。其采取分析化學領域的微流控方法，將大量稀釋后的DNA溶液分散至芯片的微反應器中，每個反應器的DNA模板數(shù)≤1個，這樣經(jīng)過PCR循環(huán)之后，當不存在任何靶標序列時，沒有信號累積，進而推算出原始溶液的DNA濃度。數(shù)字PCR為PRRSV酸檢測方面提供了新的檢測平臺，亟待利用該平臺構(gòu)建新的檢測方法。

4 防治

4.1 PRRS疫苗

近年來，PRRS的滅活苗、弱毒苗和基因工程苗的研究取得了很大的進展，并通過合理的選擇和使用免疫佐劑，如γ干擾素，霍亂毒素及可溶性β-葡萄糖等來改進疫苗的作用。Planadurán等報道，應用西班牙毒株研制成一種滅活苗，對后備母豬和母豬進行兩次免疫，有很好的保護作用[16]。滅活苗存在安全性，但是存在使用劑量大、成本高的問題。Schering-Plough公司發(fā)明了用于能繁母豬配種前3～6周使用的的弱毒苗[17]。弱毒疫苗在給豬群接種后，不僅可導致豬的病毒血癥，而且還可能通過分泌物向外排毒[18]。Clung等提出接種公豬可通過精液排毒[19]。更為嚴重的是，弱毒株的疫苗會發(fā)生返祖現(xiàn)象，轉(zhuǎn)變?yōu)閺姸局辏?996年丹麥弱毒苗免疫的豬群爆發(fā)PRRS[20]。因此，弱毒苗對PRRS陰性場、妊娠母豬、種公豬禁止使用。正因為弱毒苗和滅活苗存在這樣和那樣的問題，科研人員研發(fā)了采取腺病毒或偽狂犬病病毒為載體來表達PRRSV的主要免疫源性特性的多價基因工程苗和針對PRRSV GP5蛋白的DNA疫苗及優(yōu)化的疫苗，為PRRS安全防控提供了新的技術手段。

4.2 飼養(yǎng)管理與環(huán)境控制

應提高日糧營養(yǎng)水平，保證維生素（VE，生物素）、礦物質(zhì)5%～10%（Fe、Ca、I、Se、Mn等）含量，注意氨基酸的平衡。保持環(huán)境衛(wèi)生，消毒徹底，防止PRRSV再次感染。注意保溫，當溫度過低、過高、風速大和紫外線照射強度過大時，PRRS傳染和傳播的幾率會增大。后備母豬和育成豬混合飼養(yǎng)，或者隔離不徹底，可能引起交叉感染。做好引種隔離、人員流動控制和血清學監(jiān)測，有助于預防本病。