正交設計優選葛根超聲加熱提取工藝※

郭愛靈姚斯琪姚 濤潘斯慶周劉華常躍興*

（1 安徽理工大學醫學院藥學系，安徽 淮南 232001；2 安徽理工大學醫學前沿實驗中心，安徽 淮南 232001）

在醫藥工業大生產中葛根提取率直接影響其資源利用率，制劑生產效率及經濟效益［1］。葛根提取技術見于報道的有傳統浸提法［2］、煎煮法、加熱回流法［3-4］、半仿生提取法［5］、微波輔助提取法［6］、超聲波輔助提取法［7］、超聲波-微波輔助提取法［8］，以及用超聲波和熱回流聯合提取法等［9］。前期實驗表明，可采用超聲波輔助提取法替代加熱回流法對野葛樣品進行處理［10］。本文進一步采用超聲加熱提取方法，以主要活性成分葛根總黃酮和葛根素（puerarin，1）［11］含量為指標，對該提取工藝參數進行單因素考察和正交設計優選，以探討葛根最佳提取工藝。

1 材料

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國 Agilent公司）；Plus C 18色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm，北京迪馬歐泰科技發展中心）；UV1902型紫外可見分光光度計（上海棱光技術有限公司）；KQ-100 DE型超聲波清洗器（工作頻率為40 kHz，最大超聲功率為100 W，昆山超聲儀器有限公司）；MS105DU型十萬分之一天平（梅特勒托利多國際貿易有限公司）；BSM 220.4型分析天平（上海精卓電子科技有限公司）；DE-100 G型多功能小型粉碎機（浙江紅景天工貿有限公司）。甲醇（色譜純，美國Merk公司）；水（超純水）；葛根（采自于安徽省蕪湖市蕪湖縣境內山坡，趁鮮切成 5 μm見方的小塊，干燥備用，經山東中醫藥大學藥學院李峰教授鑒定為豆科植物野葛 Pueraria lobata (Willd.)Ohwi的干燥根）；葛根素對照品（批號為110752-201514，供含量測定用，購于中國藥品生物制品檢定研究院）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 單因素考察 根據中藥提取原理及其影響因素，本文首先以總黃酮提取率（%）和葛根素提取率（%）為指標選取超聲溫度、超聲時間、乙醇濃度以及液料比對皖南野生葛根超聲加熱提取工藝單因素進行考察。總黃酮提取率（%） 和葛根素提取率（%） 采用文獻［4］報道的方法，經方法學驗證均符合含量測定要求。

2.1.1 超聲溫度 精密稱取5 g葛根備用藥材，按照液料比為10∶1加入 60% 乙醇，浸泡30 min后分別在設定加熱溫度為 15，30，45，60℃ 下，超聲提取 30 min。提取液自然冷卻以60%乙醇補足損失的重量，振搖后過濾，棄去初濾液，取續濾液適量稀釋后在250 nm吸收波長處測定吸光度，并代入回歸方程計算總黃酮含量；取續濾液1 mL置于10 mL容量瓶，以20%乙醇定容至刻線，振搖，在2.1項色譜條件下進樣20 μL，代入回歸方程計算葛根素含量。結果如圖1a所示。

圖1 超聲溫度對皖南野葛中總黃酮及葛根素提取率的影響

從圖1a可見，隨著超聲溫度的增加，總黃酮提取率呈增加趨勢，而葛根素提取率在45℃時最高；提取溫度30℃以下對總黃酮提取率影響不大，30℃以后隨溫度增加總黃酮提取率增幅較大，而提取溫度對葛根素提取率增幅影響不大。

2.1.2 超聲時間 精密稱取5 g葛根備用藥材，按照液料比為10∶1加入60%乙醇，浸泡30 min后在設定加熱溫度為 45℃ 下分別超聲提取 15，30，45，60 min。提取液后續處理及含量測定同2.2.1項下操作，結果如圖1b所示。從圖1b可見，隨著超聲時間的延長，總黃酮和葛根素提取率均有增加的趨勢，且增幅變化較大，而超聲時間對總黃酮提取率比對葛根素提取率提高較為顯著。

圖2 超聲時間對皖南野葛中總黃酮及葛根素提取率的影響

2.1.3 乙醇濃度 精密稱取5 g葛根備用藥材，按照液料比為10∶1分別加入20%，40%，60%，80%乙醇，浸泡30 min后在設定加熱溫度為45℃下超聲提取60 min。提取液后續處理及含量測定同2.2.1項下操作，結果如圖1c所示。從圖1c可見，乙醇濃度對總黃酮和葛根素提取率及其增幅均有較大，且總黃酮和葛根素提取率在60%處均出現最大值。

圖3 乙醇濃度對皖南野葛中總黃酮及葛根素提取率的影響

2.1.4 液料比 精密稱取5 g葛根備用藥材，分別按照液料比為 5∶1，10∶1，20∶1，40∶1 加入 60% 乙醇，浸泡 30 min后在設定加熱溫度為45℃下超聲提取60 min。提取液后續處理及含量測定同2.2.1項下操作，結果如圖1d所示。從圖1d可見，隨著提取溶劑與藥材比例的增加，總黃酮和葛根素提取率均有先增加后減小的趨勢，且在液料比10∶1處出現最大值。

圖4 料液比對皖南野葛中總黃酮及葛根素提取率的影響

2.1.5 單因素考察極差分析 以不同水平為考察指標，對各單因素不同水平總黃酮提取率（%）和葛根素提取率（%）最大值與最小值之差，即極差進行統計，結果見表1。

表1 皖南野生葛根超聲加熱提取工藝單因素考察極差分析(%)

從以上結果分析，超聲溫度對總黃酮提取率（%）和 1提取率（%）影響均最大，以總黃酮提取率（%）為指標，四因素影響大小順序為超聲溫度＞超聲時間＞乙醇濃度＞液料比；以葛根素提取率（%）為指標，四因素影響大小順序為超聲溫度＞乙醇濃度＞超聲時間＞液料比。

2.2 正交實驗設計 為優選皖南野生葛根超聲加熱提取工藝，根據正交試驗設計方法原則和單因素實驗考察結果，分別設定超聲溫度 30，45，60℃，超聲時間30，45，60 min，乙醇濃度 40%，60%，80%，液料比5∶1、10∶1、20∶1，四因素三水平選用（L934）表進行實驗，因素水平表見表2。

表2 皖南野生葛根超聲加熱提取工藝正交設計

2.2.1 正交試驗極差分析 9次實驗總黃酮提取率（%）、葛根素提取率（%）實驗結果，以及采用 SPSS 23.0軟件處理所得極差分析結果均見表3。

表3 皖南野生葛根超聲加熱提取工藝正交實驗極差分析結果

從表3極差分析結果看出，乙醇濃度對總黃酮提取率（%）和葛根素提取率（%）影響均最大，直觀分析以總黃酮提取率（%）為指標最佳提取工藝為C1A3B3D2，四因素影響大小順序為 C＞A＞B＞D；以葛根素提取率（%）為指標最佳提取工藝為C2A3B3D1，四因素影響大小順序為C＞A＞B＞D。以上結果表明，提取因素對總黃酮提取率（%）和葛根素提取率（%）影響大小順序一致，僅在因素C（乙醇濃度/%）和D（液料比）水平上有一定差異。

2.2.2 正交試驗方差分析 正交試驗9次實驗總黃酮提取率（%）、葛根素提取率（%）實驗結果采用 SPSS 19.0軟件處理所得方差分析結果均見表4～5。

表4 葛根中總黃酮含量測定正交實驗方差分析

表5 葛根中葛根素含量測定正交實驗方差分析

從表4和表5方差分析結果看，A（超聲溫度）、B（超聲時間）和C（乙醇濃度）對總黃酮提取率（%）和葛根素提取率（%）均有顯著性影響，且仍然是乙醇濃度對二者影響最大；D（液料比）對總黃酮提取率（%）和葛根素提取率（%）均無顯著性影響；A（超聲溫度）、B（超聲時間）和C（乙醇濃度）三因素對總黃酮提取率（%） 和葛根素提取率 （%） 影響大小順序均為C＞A＞B。這與正交試驗極差分析結果一致，而與單因素考察實驗結果極差分析不甚一致。

2.3 驗證試驗 根據正交實驗結果對總黃酮提取最佳工藝C1A3B3和葛根素最佳提取工藝為C2A3B3進行驗證，結果見表6。

表6 葛根中總黃酮和葛根素最佳提取工藝驗證實驗結果表

從表6結果可看出，總黃酮最佳工藝 C1A3B3和葛根素最佳提取工藝為C2A3B3總黃酮提取率（%）和葛根素提取率（%）均遠高于正交設計9次實驗最大值，且重現性好，表明提取工藝條件基本穩定。然而出現了總黃酮最佳工藝 C1A3B3總黃酮提取率（%）比提取工藝為C2A3B3高0.13%的結果。

3 討論

3.1 液料比對提取工藝的影響 無論從正交實驗極差分析和方差分析結果看，D（液料比）對總黃酮提取率（%）和葛根素提取率（%）影響不甚明顯。結合實際生產，為節約材料、簡化工藝并利于后續濃縮干燥操作將 D（液料比） 均可設定為 5∶1。

3.2 單因素考察極差、正交實驗極差及正交實驗方差對比 正交實驗方差分析結果與正交試驗極差分析結果基本一致，而與單因素考察實驗結果極差分析不甚一致。這可能是因為單因素極差分析只是簡單地將最值進行加減，而正交試驗方差和極差分析則是對多組數據的影響進行綜合評價，通過最佳工藝驗證也可證明正交試驗結果的可靠性；對多因素多水平僅對單因素考察具有一定的局限性，需要加以正交設計實驗、均勻設計實驗以及響應面設計實驗等進一步驗證。

3.3 正交試驗極差分析與方差分析 正交試驗極差分析結果與方差分析基本一致，同時使用方差分析和極差分析對正交實驗數據進行分析可使二者相互印證，增加了實驗結果的可信度。

3.4 正交試驗優選工藝與驗證實驗 總黃酮最佳工藝C1A3B3總黃酮提取率（%）比提取工藝為C2A3B3高0.13%，這可能是因為總黃酮對不同水平的乙醇濃度不慎敏感，這從正交試驗不同水平乙醇濃度對總黃酮含量影響結果，特別是40%和60%這2個濃度的結果可以看出。

3.5 粉碎粒度對提取工藝的影響 為與葛根提取大生產相適應并便于過濾，實驗過程中采用藥材不粉碎而直接考察其提取工藝，實驗結果與以前樣品處理方法所得結論有所不同［10］，可能是因為粉碎粒度對葛根總黃酮和葛根素提取率的影響有很大關系，而且也會影響其他提取參數對葛根總黃酮和葛根素提取率的影響，這需要進一步驗證和考察。