產抗生素siomycin A放線菌株13-12抗菌活性探究及菌種鑒定

王 衛，王 彬，劉愛華，王 茜，邢朝斌，解云英，袁麗杰

(1.華北理工大學 基礎醫學院，河北省慢性疾病重點實驗室，唐山市慢性病臨床基礎研究重點實驗室，河北唐山 063210；2. 華北理工大學 公共衛生學院，河北唐山 063210；3.華北理工大學 生命科學學院，河北唐山 063210；4.中國醫學科學院 北京協和醫學院，醫藥生物技術研究所，北京 100050)

隨著臨床耐藥菌株的不斷出現，一些陳舊的抗生素效果大幅下降，尋找新的菌株、新的抗生素迫在眉睫[1]。如今人們所使用的抗生素絕大部分是放線菌和真菌產生的天然產物及其衍生物[2]，目前所報道的來自放線菌抗生素大部分是由鏈霉菌屬(Streptomyces)產生[3]，其他菌屬相對較少，但由于鏈霉菌這一放線菌的優勢菌種被不斷重復發現，排重困難，使得發現新抗生素的機率逐漸下降。

近年來從土壤環境中分離篩選產生新天然活性物質的放線菌日益困難，人們逐漸把目光投向之前較少研究的微生物特殊棲息環境如植物內部[4]，希望采用該種方法，來探尋能產生新的代謝活性物質的放線菌。

在人類生存和發展的歷史長河中，藥用植物扮演著不可或缺的重要角色。做為藥用植物的重要內生菌組成部分，內生放線菌廣泛存在于其中，因其豐富的物種多樣性使其在植物微生態系統中占據十分重要的地位。內生菌作為植物體的一部分與藥用植物的“協同進化”關系決定了某些內生菌具有產生與宿主植物相同或相似生物活性的能力[5]。已有研究表明，從藥用植物體內部篩選得到的放線菌產生的次級代謝物質具備多種生物活性。Zhao等[6]從美登木(MaytenushookeriLoes.)中篩選到的內生放線菌鏈霉菌Is9131(Streptomycessp. Is9131)，從菌株的代謝產物中分離到dimeric nonactin和dimeric dinactin兩種大環內酯類化合物，有較強的抗菌和抗腫瘤活性。一些分離自歐洲紅豆杉(TaxusbaccataL.)中的內生放線菌菌株[7]，能夠產生紫杉烷類物質，該類物質對多種癌癥具有良好的治療效果。桑氏鏈霉菌Waksman (StreptomycessampsoniiWaksman)篩選自衛矛科植物內部，具備產生抗生素chloropyrrol的能力[8]。由此可見，從藥用植物中來分離放線菌資源，并進一步從其中分離出與藥用植物相類似作用的天然活性物質，除了可以避免傳統藥用植物的過度利用外，還能為研發新型藥物奠定良好的基礎。

刺五加(Acanthopanaxsenticosus)隸屬于五加科(Araliaceae)五加屬(Acanthopanax)，是中國北方道地藥材，具有抗菌、抗腫瘤等多種作用[9]。按照“協同進化”理論，刺五加植株內部也可能有可以產生類似活性物質的內生放線菌存在。為此，華北理工大學微生物資源課題組對刺五加內生放線菌資源進行挖掘，對其內生菌株抑菌活性初篩后，發現了具有較好抑菌活性的菌株13-12。本研究針對菌株13-12發酵液的抑菌活性及其穩定性進行評價，明確活性物質提取條件；通過PCR檢測菌株13-12活性物質合成相關的功能基因；結合其形態、生理及分子特征對菌株進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 菌 株

供試放線菌：放線菌13-12分離自野生刺五加根莖部。ISP2培養基斜面28 ℃培養7 d，4 ℃保存；φ=25%甘油管置于-80 ℃冰箱保藏。

供試檢定菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、大腸埃希菌(Escherichiacoli)，草分枝桿菌(Mycobacteriumphei)、恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)，白色念珠菌(Candidaalbicans)，大腸埃希菌耐藥菌株(E.coliATCC 35218)、金黃色葡萄球菌耐藥菌株(MRSA12-1、MRSA ATCC43300)。檢定菌由中國醫學科學院北京協和醫學院，醫藥生物技術研究所解云英副研究員、孫承航研究員提供。

將供試檢定菌接種于Nutrient agar培養基，置于37 ℃恒溫箱培養1 d，其中恥垢分枝桿菌置于35 ℃，白色念珠菌置于28 ℃，待培養良好后用φ=25%的甘油溶液將其吹打制成菌懸液備用。

1.2 菌株發酵液制備

菌株13-12接種于ISP2培養基上28 ℃活化7 d后，轉接至液體發酵培養基中，培養基組分：可溶性淀粉20.0 g、葡萄糖5.0 g、蛋白胨5.0 g，酵母膏5.0 g，牛肉膏5.0 g，黃豆餅粉10.0 g，玉米漿4.0 g，CaCO34.0g，CoCl2(w=0.02%) 1.0 mL、去離子水1 L，調整最終pH至7.2；裝液量為三角燒瓶體積的1/5；28 ℃、180 r/min振蕩培養5 d；將發酵產物4 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

1.3 抗菌活性試驗

抑菌譜測定采用平板紙片法[10]，對供試放線菌13-12的發酵液進行抑菌活性測定。將檢定菌菌懸液用生理鹽水分別對各指示菌菌液進行梯度稀釋，稀釋約為 1×108cfu/mL，取上述各種菌懸液 0.1 mL于無菌平皿中，然后倒入已冷卻至 55 ℃的高壓滅菌后的培養基15 mL，充分混勻在適當位置貼上己滅菌的濾紙片(Φ=5 mm)，然后分別吸取發酵液30 μL置于濾紙片上，同時以發酵培養基作陰性對照。將不同帶菌平板置于37 ℃恒溫培養箱(白色念珠菌置于28 ℃、恥垢分枝桿菌置于35 ℃) 18～24 h。重復3次，抑菌圈直徑采用十字交叉法進行測量。

1.4 發酵液穩定性試驗

根據抑菌譜測定結果選定供試檢定菌，測定發酵液穩定性。以未處理的發酵液原液為對照，分別測定發酵液在不同光照時間(室溫光照條件下放置24、48、72、96 h)，溫度(將發酵液于4、20、40、60、80 ℃分別處理2 h，冷卻至室溫)及酸堿(將發酵液分別調pH到2、4、6、8、10，4 ℃放置8 h 后再回調到原始pH)條件下抑菌圈直徑，各處理重復3次。

1.5 功能基因研究

采用Chelex-100法來提取基因組DNA[11]，作為功能基因檢測及16S rRNA序列擴增模板，-20 ℃保存。

次級代謝產物合成的相關功能基因片段的擴增引物參照不同文獻[Ⅰ型聚酮酶基因(PKSⅠ)[12]、Ⅱ型聚酮酶基因(PKSⅡ)[12]、非核糖體肽合成酶基因(NRPS)[13]、鹵化酶基因(Halo)[14]、細胞色素酶基因(CYP)[14]]，擴增產物利用的瓊脂糖凝膠(10 g/L)電泳檢測，電壓110 V，30 min。

將PCR產物電泳選擇陽性功能基因片段切膠回收，與pGM-T載體連接、轉化、篩選、挑取單克隆，37 ℃振蕩培養3 h后進行菌液PCR鑒定，選擇陽性克隆擴大培養，提取質粒后送至北京賽默飛世爾科技有限公司進行測序。

登錄NCBI官網(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/)，使用VecScreen程序去除測序中載體序列；使用DNAMAN 8.0軟件將目的核酸序列轉換為氨基酸序列；最后利用BLAS Tp程序進行氨基酸序列同源性比對。

1.6 菌株鑒定

形態學觀察用ISP3培養基于28 ℃條件下進行埋片培養[15]，分別培養7、14、21 d后取出埋片，利用光學顯微鏡(BX-53; Olympus)觀察基內菌絲，氣生菌絲的形態特征，掃描電鏡(model S-4800; Hitachi)觀察菌株孢子形態特征。

培養特征觀察參照國際鏈霉菌計劃進行[16]。選用培養基ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、ISP7、察氏瓊脂、馬鈴薯浸汁瓊脂、營養瓊脂接種，28 ℃培養7、14、21、28 d后分別觀察記錄基內菌絲、氣生菌絲的生長情況及可溶性色素。

生理生化特征測定試驗方法參照文獻[17]。溫度(4、10、15、23、28、37 和 45 ℃)、 pH 5.0～11.5 (間隔為0.5)、鹽耐受(質量分數0、1%、2%、3%、5%、7%、10%、15%、20%)均以ISP2為基礎培養基。通過3% H2O2產生氣泡作為過氧化氫酶活性的陽性判定[18]；纖維素水解所用基礎培養基依據文獻[19]配置；利用北京陸橋微生物生化微量鑒定管獲得唯一碳源及酶特性指標。

16S rRNA序列測定及分析：擴增引物PA(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)；PB(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)。擴增條件：預變性95 ℃、5 min，變性95 ℃、1 min，退火54 ℃、45 s，延伸72 ℃、1.5 min，35個循環；72 ℃ 延伸10 min。產物測序由上海英濰捷基生物公司進行。依據測序結果，在EzTaxon database(http://eztaxon-e. ezbiocloud.net/)[20]核酸數據庫中進行13-12菌株16S rRNA基因序列比對。選取相似性較高菌株序列，用ClustalX[21]和MEGA5.0[22]軟件包采用鄰接法(Neighbor-Joining method)[23]進行聚類分析系統進化樹構建，拓撲結構穩定性分析采用1 000 次重復取樣。

2 結果與分析

2.1 菌株13-12抗菌活性

菌株13-12發酵液對枯草芽孢桿菌、草分枝桿菌有較好的抑菌活性，抑菌圈直徑達18～20 mm，對金黃色葡萄球菌以及耐藥菌株MRSA12-1、MRSA43300有一定的抑制作用，對于大腸埃希菌、銅綠假單胞菌以及恥垢分支桿菌沒有明顯的抑菌活性(表1)。

2.2 放線菌13-12菌株發酵液穩定性

將菌株13-12發酵液放置在室溫條件下光照處理24、48、72、96 h，結果表明：處理24 h發酵液抑菌活性基本沒有變化；處理48、72、96 h抑菌活性均出現明顯降低(圖1-A)。發酵液中一些活性物質在室溫光照條件下可能分解或發生結構上的改變。因此，在對發酵液活性物質分離提取過程中應避免長時間暴露在室溫光照條件下，最好避光。

如圖(1-B)所示，發酵液在4 ℃與20 ℃抑菌活性穩定，隨著溫度的升高發酵液的抑菌活性出現降低。發酵液經40 ℃處理2 h后，其對枯草芽孢桿菌的抑制作用(16.00 mm)較20 ℃條件下(16.53 mm)沒有明顯變化，對其他檢定菌的抑制作用均有不同程度降低。當溫度達到80 ℃發酵液對金黃色葡萄球菌抑制作用幾乎消失，說明發酵液中活性物質在溫度條件達到40 ℃以上時可能出現結構變化，抑菌活性降低。因此，在分離提純發酵液中活性物質時，需將溫度控制在4～20 ℃為宜。

如圖(1-C)，發酵液收獲時pH為7.7(control=7.7)，總體來看菌株12發酵液在pH為6～8時較未處理的對照組抑菌活性變化幅度較小，當pH為2與10時抑菌活性降幅較明顯。其中發酵液在pH在2～10條件下對草分枝桿菌的抑制活性卻較為穩定。說明應將pH控制在6～8對于發酵液中活性物質分離純化最有利。

表1 菌株13-12發酵液抑菌活性Table 1 Antibacterial activity of fermentation

2.3 菌株13-12功能基因

菌株功能基因PCR擴增結果見圖2，分別得到NRPS基因及Halo基因擴增產物。克隆測序得到菌株13-12的NRPS基因長度為732 bp，共編碼氨基酸243個，經BLASTp比對與數據庫(Genbank)中奇跡束絲放線菌(Actinosynnemamirum)和橄欖產色鏈霉菌(Streptomycesolivochromogenes)非核糖體肽合成酶(NRPS)同源性最高，達63%(表2)；Halo基因序列長度為560 bp，編碼185個氨基酸，經BLASTp比對與Genbank數據庫中球形浮游動單胞菌(Planomonosporasphaerica)的鹵化酶(Halo)同源性最高，達98%(表3)。

圖1 菌株13-12發酵液在不同條件下抑菌活性變化Fig.1 Stability of fermentation broths of 13-12 under the different condition

M.100 bp DNA ladder; A.PKSⅠ; B.PKSⅡ; C.NRPS; D.Halo; E.CYP

圖2菌株13-12功能基因電泳圖
Fig.2Electrophoregramofstrain13-12functionalgenes

2.4 菌株13-12分類鑒定

2.4.1 菌株13-12形態特征 菌株13-12在ISP2培養基上生長狀態良好，菌落表面干燥呈現橘紅色(圖3)。通過光學顯微鏡和掃描電鏡觀察發現其基內菌絲豐富，分枝不規則，菌絲生長連續無斷裂(圖4)。氣生菌絲發育良好，在氣生菌絲上產生有孢囊柄，柱狀孢囊成簇狀排列在孢囊柄上(圖5)。

2.4.2 菌株13-12培養特征 菌株13-12在不同培養基表現出不同的培養特征，在ISP2、ISP3、馬鈴薯浸汁瓊脂以及營養瓊脂培養基中生長良好，基內菌絲豐富，基內菌絲通常是乳白色至淡粉色或淡橙色。在ISP2、ISP3和葡萄糖-天冬酰胺瓊脂等培養基上出現少量白色氣生菌絲，在少數供試培養基上可以產生可溶性色素，具體培養特征情況見表4。

表2 菌株13-12NRPS 基因比對結果Table 2 Homogeneous comparing of itsNRPS amino acids sequencies

表3 菌株13-12Halo 基因比對結果Table 3 Homogeneous comparing of its halogenase amino acids sequencies

圖3 13-12在ISP2培養基上的生長狀況Fig.3 Cultural of strain 13-12 on ISP2 media

圖4 菌株13-12掃描電鏡基內菌絲Fig.4 Substrate mycelium of Strain13-12 on ISP3 Medium scanned by SEM

2.4.3 生理生化特征 菌株13-12在pH 6.5～8.0的條件下均可生長，其生長最適pH為7.5～8.0；生長溫度范圍為15～45 ℃，當溫度為28 ℃時生長狀態最好，在37～45 ℃生長能力減弱較為明顯；菌株13-12在NaCl質量分數小于等于1%的培養基上生長；菌株能夠使明膠液化、淀粉水解、纖維素水解；不能使牛奶凝固，脲酶及氧化酶陰性等；能夠以葡萄糖、果糖、肌醇、乳糖等為碳源生長；所測試氮源中能夠利用酪蛋白、L-谷氨酸、L-甲硫氨酸、L-丙氨酸、DL-丙氨酸等；生理生化特征見表5。

圖5 菌株13-12掃描電子顯微鏡Fig.5 Aerial hyphae of Strain13-12 on ISP3 Medium scanned by SEM

2.4.4 16S rRNA序列測定結果 測得菌株13-12 16Sr RNA序列全長1 398 bp，在EzTaxon database核酸數據庫比對，發現菌株13-12與Planomonospora屬菌株高度相關，是Planomonospora的成員。選取序列比對率較高的菌株，利用MEGA5.0分析構建的系統進化樹上(圖6)，菌株13-12與Planomonospora屬的典型菌株PlanomonosporasphaericaJCM 9374T以極高的基因序列相似性(99.5%)聚于一個系統進化分支上。結合形態、生理特征以及系統發育樹分類鑒定結果，初步將菌株13-12鑒定為Planomonosporasphaerica一個菌株。

表4 菌株13-12的培養特征Table 4 The cultural characteristics of 13-12 on different media

表5 菌株13-12生理生化特征Table 5 Physiological and biochemical characteristics of strain 13-12

注：“+”陽性生長，“-”陰性。

Note:“+” positive，“-” negative.

3 討 論

放線菌是天然活性產物的主要來源，目前約有2/3的抗生素來源于放線菌，并被人們開發用于醫學、農業病害防治和環境保護等方面。因此，針對具有良好生物活性的菌株進行系統研究，對于深入挖掘其有效成分具有重要指導意義。研究結果顯示，菌株13-12發酵液主要對革蘭氏陽性菌表現出較好的抑制活性。在室溫、避光及 pH6～8范圍內發酵液活性較穩定。

目前，科研人員分析放線菌全基因組序列測定結果發現，次級代謝產物合成相關基因呈現特殊的相似性及多樣性，因此，基于特殊基因的一致性開展活性產物篩選成為放線菌活性物質篩選的重要手段。

圖6 菌株13-12系統發育樹Fig.6 The phylogenetic tree of strain 13-12 based on 16S rRNA complete sequences

這種方法一方面可以探究菌株是否可以產生特定的生物活性物質；另一方面也可以在基因水平上衡量其產生生物活性物質的潛能。在目前已知的放線菌相關功能基因中，NRPS基因是負責非核糖體肽生物合成的主要酶基因，常作為菌株產生新穎結構活性化合物的指示。關于Halo基因，學者發現鹵化酶催化的鹵化作用在抗生素生物合成途徑中起著重要作用[24]，可極大提高代謝產物的抑菌活性。放線菌菌株13-12含有NRPS基因和Halo基因。在NRPS氨基酸序列比對中，與其同源性最高的是比對為63%的奇跡束絲放線菌(Actinosynnemamirum)和橄欖產色鏈霉菌(Streptomycesolivochromogenes)。奇跡束絲放線菌已報道可產生β-內酰胺類抗生素諾卡菌素A(nocardicin A)，其對革蘭氏陰性菌有一定抗菌活性[25]。此類抗生素是臨床最常用的抗感染藥物[26]。與菌株13-12 NRPS 氨基酸序列相似性為62%的網狀鏈霉菌(Streptomycesreticuli)可產生大環內脂類抗生素白霉素(leucomycin)[27]。菌株13-12 Halo氨基酸序列與異壁鏈霉菌屬ATCC 53650(Streptoalloteichussp. ATCC 53650)鹵化酶氨基酸序列相似性達78%，可以合成具有抗腫瘤活性的抗生素可達菌素(kedarcidin)，可達菌素同時對革蘭氏陽性菌有很強的抑菌活性[28]；與球形浮游動單胞菌(Planomonosporasphaerica)色氨酸鹵化酶氨基酸序列同源性高達98%，球形浮游動單胞菌產生硫肽類化合物硫鏈絲菌素[29](thiostrepton)已被美國食品藥品監督管理局批準用于清除動物腸道寄生菌[30]。由此可見，菌株13-12可能具有產生β-內酰胺類抗生素、大環內脂類抗生素、可達菌素以及硫鏈絲菌素等多類抗菌抗腫瘤活性物質或其相似產物的潛能。

本研究通過形態特征、培養特征、生理生化及16S rRNA系統分析等方法對菌株13-12進行菌株鑒定。菌株13-12屬于游動單胞菌屬(Planomonospora)有效發表種球形浮游動單胞菌JCM 9374T的一個菌株，目前該菌種尚未有在刺五加藥材中分離到的報道。游動單胞菌屬(Planomonospora)屬于鏈孢囊菌科(Streptosporangiaceae)，該屬已發表標準菌株有5個種和2個亞種，包括巴龍特孢浮游單胞菌巴龍特亞種(P.parontosporasubsp.parontospora)[31],巴龍特孢浮游單胞菌抗生素亞種(P.parontosporasubsp.antibiotica)[32],委內瑞拉浮游單胞菌(P.venezuelensis)[33]，阿爾巴浮游單胞菌(P.alba)，球形浮游動單胞菌(P.sphaerica)[29]和珊瑚藻游動單胞菌(P.coralline)[34]。目前該屬已報道產生抗生素的菌株有分離自土壤的巴龍特孢浮游單胞菌抗生素亞種，可產生酯肽類抗生素孢囊霉素(sporangiomycin)[32]，對革蘭氏陽性菌具有較好的抑菌活性。還有菌株阿爾巴浮游單胞菌(P.alba)，產生羊毛硫細菌素類抗菌肽planosporicin[35]，可干擾革蘭氏陽性菌細胞壁代謝，克服現有的細菌耐藥機制，是很具前景的現有抗生素替代物[36]。羊毛硫細菌素類抗菌肽已應用于作為食品添加劑以及對抗痤瘡丙酸桿菌(PropionibacteriumAcnes)和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)并表現出了其有效性和實用性[37]。P.sphaerica分離自土壤，產生硫鏈絲菌素(thiostrepton)，據報道硫鏈絲菌素及其衍生物是目前發現的唯一一類能夠主動作用于宿主細胞和胞內寄生菌，并在殺滅病原菌的同時提高宿主免疫防御能力的抗生素[30]。

在上述實驗研究基礎上，華北理工大學微生物資源課題組已從菌株13-12中分離到硫肽類抗生素鹽窩霉素A(siomycin A)[38]。關于鹽窩霉素A作為FoxMl的抑制劑的研究一直備受關注。鹽窩霉素A特異性的作用于在FoxMl[39]，FoxMl是叉頭框轉錄因子(Forkhead box)家族的一個轉錄因子，在多種不同的惡性腫瘤組織中均存在高表達[40]，與腫瘤的發生發展密切相關，成為腫瘤治療一個藥物新靶標。最近研究表明，鹽窩霉素A能有效抑制胸腺癌、肺腺癌等細胞的生長[41]。因此，鹽窩霉素A很有可能成為新的抗癌藥物。菌株13-12作為鹽窩霉素A的產生菌具有較高研究開發價值和應用潛力。另外，根據菌株13-12功能基因檢測及發酵液穩定性探究，推測菌株13-12可能還有其他活性產物未得到分離，目前后續產物分離純化工作正在進行中。

因此，對菌株基本生理特點及活性產物穩定性的系統研究，可為菌株次級代謝產物的分離純化確定合適的條件，為深入挖掘穩定性良好的活性成分提供優良菌源，為刺五加內生放線菌資源的開發利用提供依據。同時，野生刺五加屬于我國瀕危藥用植物，本研究篩選得到的菌株，所產生的次級代謝產物與宿主植物部分藥效相似，可為刺五加生長緩慢、資源緊缺等引起的藥源匱乏和生態破壞問題提供新出路，對瀕危植物資源的保護具有重要意義。