超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定蔬菜中23種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留

張維一，張 井，高晴盈，謝拾冰，王 亮，梁秀美

(溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗站，浙江溫州 325006)

植物生長調(diào)節(jié)劑是一類具有植物激素活性，可影響植物生長發(fā)育的小分子化合物。這類化合物在增強植物抗逆性、促進(jìn)植物細(xì)胞分裂與生長、提高產(chǎn)量以及改善品質(zhì)等方面具有重要的作用，因而作為高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高效農(nóng)業(yè)的一項重要技術(shù)措施，已在國內(nèi)外得到廣泛應(yīng)用[1-6]。

但在植物生長調(diào)節(jié)劑殘留的檢測方法上，蔬菜中檢測標(biāo)準(zhǔn)覆蓋面不全，相關(guān)文獻(xiàn)報道較少， 而一些檢測響應(yīng)較為理想的方法又存在費用高、處理復(fù)雜的問題。國內(nèi)外農(nóng)藥殘留的檢測技術(shù)主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA) 、氣相色譜法(GC) 、氣相色譜一質(zhì)譜法(GC-MS) 、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)和離子色譜法(IC) 等[5-10]。其中串聯(lián)質(zhì)譜因其優(yōu)異的定性與定量性能越來越得到廣泛應(yīng)用。而在蔬菜中農(nóng)藥殘留前處理方法上，近年來QuEChERS方法因其簡單、快速而得到廣泛應(yīng)用。目前，國內(nèi)外雖然已有一些采用QuEChERS方法和液相串聯(lián)質(zhì)譜測定植物生長調(diào)節(jié)劑殘留的報道[1-6，11]，但是對于同時測定多種性質(zhì)差異較大的植物生長調(diào)節(jié)劑的通用方法報道較少。本研究以液相串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)為基礎(chǔ)，通過優(yōu)化QuEChERS方法以及儀器條件，為同時測定多種性質(zhì)不同的植物生長調(diào)節(jié)劑提供相應(yīng)的簡單、快速、可靠、靈敏的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

XEVO TQS超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀購自美國WATERS公司，Milli-Q Direct 8 超純水儀購自美國Millipore公司，SK3300HP超聲波清洗器購自上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司，MS7610-33 漩渦振蕩器購自美國Thermo Fisher公司， TG16-WS離心機(jī)購自上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司，ROTINA 380離心機(jī)購自德國海蒂詩公司，分散勻漿機(jī)購自德國IKA集團(tuán)，AR1502CN電子天平購自奧豪斯儀器有限公司，氮吹儀購自美國Organomation公司。

溶液農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所， 固體農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品購自德國Dr.Ehrenstorfer公司，C18購自德國CNW公司，弗羅里硅土購自美國WZ.der.Floridin公司，石墨化炭黑購自德國CNW公司，545硅藻土購自德國CNW公司，60～200 μm超純硅膠購自加拿大SILICYCLE公司，酸性氧化鋁購自德國CNW公司，堿性氧化鋁購自德國CNW公司，PSA購自德國CNW公司，無水硫酸鎂(分析純)購自西隴化工股份有限公司，乙腈(色譜純)購自德國默克公司，甲醇(色譜純)購自德國默克公司，甲酸(色譜純)購自德國默克公司， 0.22 μm濾膜購自上海安譜實驗科技股份有限公司，實驗室用水為超純水。

1.2 樣品前處理方法

準(zhǔn)確稱取10.0 g樣品于離心管中，加入2.5 g無水硫酸鎂，加入φ=1%甲酸-乙腈 10.0 mL，渦旋1 min后6 000 r·min-1離心5 min。取1.0 mL上清液于1.5 mL離心管，加入100 mg 無水硫酸鎂、20 mg硅藻土、50 mg C18，渦旋30 s后10 000 r·min-1離心10 min，0.22 μm濾膜過濾，待LC-MS/MS測定。

1.3 液相串聯(lián)質(zhì)譜條件

超高效液相色譜條件：色譜柱使用HSS T3柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm; 美國WATERS公司)； 流動相A為φ=0.1%甲酸-乙腈溶液，流動相B為φ=0.1%甲酸-水溶液(內(nèi)含0.1 g·L-1甲酸銨)； 梯度洗脫程序為：0～1 min，5% A；1～2 min，10% A；2～3 min，50% A；3～4 min，90% A；4～5 min，90% A；5～8 min，5% A。流速為0.4 mL·min-1，柱溫40 ℃，樣品進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正負(fù)離子切換掃描；脫溶劑氣流 800 L·h-1脫溶劑溫度為300 ℃，錐孔氣流為150 ℃，鞘氣壓力(氮氣)為7.0 Bar；正離子掃描下毛細(xì)管電壓3.90 kV，錐孔電壓25 V；負(fù)離子掃描下毛細(xì)管電壓1.50 kV，錐孔電壓25 V；數(shù)據(jù)采集采用多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 提 取 選擇常見蔬菜大白菜為試驗對象，通過添加回收試驗，考察不同試劑的提取效果。具體過程如下：稱取10 g勻漿樣品3份，添加植物生長調(diào)節(jié)劑標(biāo)物，30 min后加入提取試劑，渦漩1 min，6 000 r·min-1離心5 min，取上清，0.22 μm濾膜過濾，液質(zhì)檢測，通過計算23種植物生長調(diào)節(jié)劑的回收率來考察提取效果。首先考察甲醇、乙腈、乙酸乙酯、水、φ=50%的甲醇水溶液、φ=50%的乙腈水溶液6種試劑的提取能力，具體結(jié)果見表1前半部分。試驗結(jié)果顯示，水的存在會造成部分疏水性較強的植物生長調(diào)節(jié)劑回收率極低。進(jìn)一步選取甲醇乙腈兩種有機(jī)溶劑進(jìn)行考察[12-14]，并加入2.5 g無水硫酸鎂去除蔬菜中水分，同時考察加入甲酸對于提取效率的影響，結(jié)果見表1后半部分。試驗表明，去除水分能明顯改善有機(jī)溶劑對目標(biāo)物的總體提取效果，而乙腈提取的最低回收優(yōu)于甲醇，因此選擇乙腈作為提取溶劑；且乙腈中加與不加甲酸對結(jié)果影響極小，酸性環(huán)境下不會降低回收，考慮到樣品本身的復(fù)雜性(不局限于大白菜)可能會對回收造成影響，選擇加入甲酸適用性會更廣，因此確定提取試劑為φ=1%甲酸-乙腈，并加入2.5 g無水硫酸鎂。

表1 不同提取劑對23種植物生長調(diào)節(jié)劑總體回收情況Table 1 Recovery of 23 plant growth regulators with different extraction solvents

2.1.2 凈化 考察C18、PSA、GCB等常見的固相萃取柱填料對于待測目標(biāo)物含量的影響。過程如下：取3份待凈化大白菜提取液，添加植物生長調(diào)節(jié)劑標(biāo)物，加入100 mg無水硫酸鎂，加入凈化劑渦旋30 s，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液，0.22 μm濾膜過濾，液質(zhì)檢測，計算23種植物生長調(diào)節(jié)劑的回收率來考察凈化劑對目標(biāo)物的吸附情況(表2)。8種凈化劑(20 mg)對目標(biāo)物回收率的中位數(shù)較理想，但除C18和硅藻土外，其他凈化劑均存在對少數(shù)幾種植物生長調(diào)節(jié)劑吸附較強導(dǎo)致最低回收率偏低的情況。進(jìn)一步考查C18和硅藻土的組合使用量對目標(biāo)物的吸附情況，分別對20 mg、50 mg的C18、硅藻土以及相應(yīng)的組合進(jìn)行添加回收試驗。結(jié)果(表2)表明：除50 mg C18+50 mg 硅藻土的凈化劑組合的最低回收小于80%外，其余凈化方案對回收影響均可以接受，且回收情況差異不大；因此選擇50 mg C18+20 mg 硅藻土作為凈化劑。

表2 不同凈化劑凈化后的植物生長調(diào)節(jié)劑總體回收情況Table 2 Recovery of 23 plant growth regulators with different purifying agents

2.2 儀器條件的優(yōu)化

2.2.1 液相色譜條件 比較3種色譜柱C18柱、T 3柱和Hillc柱(美國Thermo Fisher公司)對23種植物生長調(diào)節(jié)劑的保留情況。結(jié)果顯示，C18柱對于部分極性較強的植物生長調(diào)節(jié)劑保留不理想，Hillc柱對于多數(shù)非極性植物生長調(diào)節(jié)劑保留能力差，T 3柱對于這23種不同性質(zhì)的植物生長調(diào)節(jié)劑均有較好的保留，因此選用T 3柱。在此基礎(chǔ)上，比較流動相有機(jī)相甲醇與乙腈對于分離的影響，發(fā)現(xiàn)選用乙腈作為流動相整體分離效果略好。進(jìn)一步比較流動相加不加酸對于質(zhì)譜端響應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)加酸能顯著增強部分采用ESI+模式掃描的植物生長調(diào)節(jié)劑響應(yīng)，且并未對ESI-模式掃描的這部分植物生長調(diào)節(jié)劑造成大的響應(yīng)減值；因此流動相有機(jī)相確定為φ=0.1%甲酸-乙腈溶液，水相為φ=0.1%甲酸-水溶液(內(nèi)含0.1 g·L-1甲酸銨)。

2.2.2 質(zhì)譜條件 優(yōu)化錐孔氣流、毛細(xì)管電壓等儀器條件設(shè)置、篩選高響應(yīng)特異離子對等質(zhì)譜條件，采用正負(fù)離子切換掃描多反應(yīng)監(jiān)測的方式一針進(jìn)樣完成對所有目標(biāo)植物生長調(diào)節(jié)劑的檢測。具體結(jié)果見表3。

2.3 方法評價

2.3.1 線性范圍、檢出限、定量限 空白樣品中添加一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，每個質(zhì)量濃度6次重復(fù)，計算線性范圍，并以目標(biāo)物質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)(y，單位為 μg·L-1)，質(zhì)譜定量離子的峰面積為橫坐標(biāo)(x)來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體結(jié)果見表4。試驗結(jié)果表明，各目標(biāo)物線性關(guān)系良好，線性范圍較寬。

根據(jù)信噪比(S/N=3)確定方法檢出限，根據(jù)信噪比(S/N=10)以及線性范圍確定方法定量限(表4)。試驗結(jié)果表明，檢出限范圍為0.007 1～4.3 μg·kg-1，定量限范圍為0.024～14 μg·kg-1，多數(shù)植物生長調(diào)節(jié)劑檢出限和定量限在1.0 μg·kg-1以下，該方法對23種植物生長調(diào)節(jié)劑的檢測靈敏度較高。

表3 23種植物生長調(diào)節(jié)劑的質(zhì)譜參數(shù)Table 3 Mass spectrometric conditions for 23 kinds of plant growth regulators

2.3.2 基質(zhì)效應(yīng) 采用相對響應(yīng)值法對此進(jìn)行評價(基質(zhì)效應(yīng)=空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值)，基質(zhì)效應(yīng)大于1為基質(zhì)增強效應(yīng)，反之則為基質(zhì)抑制效應(yīng)[15]；對41種蔬菜進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)評價，試驗結(jié)果表明，23種植物生長調(diào)節(jié)劑在這41種蔬菜中平均基質(zhì)效應(yīng)為0.49，其中92%的情況為基質(zhì)抑制，基質(zhì)效益為0.007 5～2.0，基質(zhì)效應(yīng)對這一系列植物生長調(diào)節(jié)劑的質(zhì)譜響應(yīng)影響較大，因此必須通過使用基質(zhì)配置標(biāo)準(zhǔn)溶液或添加同位素內(nèi)標(biāo)的方式來消除基質(zhì)效應(yīng)影響。

2.3.3 方法的準(zhǔn)確度與精密度 對大白菜等蔬菜樣品進(jìn)行低質(zhì)量濃度加標(biāo)回收試驗以考察方法的準(zhǔn)確度，同時計算6次重復(fù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差來考察該方法在目標(biāo)物低質(zhì)量濃度條件下的精密度，具體結(jié)果見表5。

試驗結(jié)果表明，在10倍定量限的加標(biāo)水平下，23種植物生長調(diào)節(jié)劑平均回收率為73.1%～121.3%，在70%～130%內(nèi)，且大部分平均回收率為80%～100%，總體情況良好，準(zhǔn)確度符合試驗要求。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差多數(shù)小于5%，方法精密度較為理想；但甲哌啶等4種植物生長調(diào)節(jié)劑相對相對標(biāo)準(zhǔn)偏差大于10%，雖符合15%的試驗基本要求，也提示這幾種植物生長調(diào)節(jié)劑在試驗過程中可能存在結(jié)果不穩(wěn)定的情況。

表4 23種植物生長調(diào)節(jié)劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 4 Linearity,LOD and LOQ of 23 plant growth regulators

表5 23種植物生長調(diào)節(jié)劑的加標(biāo)平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 5 Average recovery and relative standard deviation of 23 plant growth regulators

2.4 實際樣品分析

使用本研究的試驗方法對市場和基地抽檢的15個芹菜、25個絲瓜、30個茭白共計70個樣品進(jìn)行檢測驗證。總體上，脫落酸的檢出率為40%，在3種蔬菜中檢出率均極高，但質(zhì)量濃度較低，幾乎都在10 μg·kg-1以下，考慮來源為蔬菜內(nèi)源激素。其中芹菜中檢出較高的有矮壯素(13.3%)和赤霉素(6.7%)，絲瓜中檢出較高的為氯吡脲(32%)和5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉(16%)，茭白中檢出較高的主要有矮壯素(36.67%)，檢出的農(nóng)藥類型及含量情況基本與這幾種蔬菜的生產(chǎn)用藥情況相符，說明該方法準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論與討論

選取性質(zhì)相差較大的23種植物生長調(diào)節(jié)劑為目標(biāo)，通過優(yōu)化QuEChERS提取及凈化方法，得到對這23種植物生長調(diào)節(jié)劑進(jìn)行同時提取較為合適的前處理方法，但具體到單個植物生長調(diào)節(jié)劑并非最佳方法，而是一種通用性較好的前處理方式；同時在凈化上對一些QuEChERS不常用的材料進(jìn)行嘗試，找到一組較為理想的凈化試劑組合；通過對色譜柱、流動相等液相端及離子對等質(zhì)譜端條件的優(yōu)化，進(jìn)一步使該方法能同時滿足一次性檢測性質(zhì)相差較大目標(biāo)物。此外，通過基質(zhì)加標(biāo)回收等方法驗證得到令人滿意的方法評價參數(shù)。相對于傳統(tǒng)方法，本方法簡單、快速、有效，能夠同時測定蔬菜中性質(zhì)相差較大的23種植物生長調(diào)節(jié)劑，極大節(jié)約分析時間和成本。