矮牽牛海藻糖-6-磷酸合酶基因PhTPS6的克隆與表達分析

王 琦，劉同瑞，劉 娜，熊 楓，張水明，董麗麗

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，合肥 230036)

海藻糖(Trehalose)是一類廣泛存在于細(xì)菌、酵母、真菌、昆蟲、無脊椎動物以及植物中的非還原性雙糖[1]。植物中海藻糖主要以TPS/TPP途徑合成：海藻糖-6-磷酸合酶(Trehalose 6-phosphate synthase，TPS)將尿嘧啶核苷二磷酸-葡萄糖(UDP-glucose)與6-磷酸葡萄糖催化生成海藻糖-6-磷酸，隨后經(jīng)由海藻糖-6-磷酸酯酶(Trehalose-6-phosphate phosphatase, TPP)催化生成為海藻糖[2](圖1[3])。

TPS作為調(diào)節(jié)海藻糖合成的關(guān)鍵酶[4]，其成員能夠參與調(diào)節(jié)植物的抗逆[5]、成花轉(zhuǎn)變[6]和分枝發(fā)育[7]。不同物種中TPS家族成員數(shù)量不同：如擬南芥、水稻、楊樹[8]、橡膠樹[9]等物種中分別含有11、11、12、14個成員。TPS成員通常分為ClassⅠ與ClassⅡ兩個亞家族, 后者具有合酶和磷酸酶結(jié)構(gòu)域，但其功能目前并不明晰[10]。TPS6及其他物種中的同源基因通常屬于ClassⅡ[4,11-12]。有研究顯示AtTPS6的過表達不能互補酵母tps1和tps2的突變體表型，表明其不具有活性或不能直接參與海藻糖代謝[13]。但也有研究發(fā)現(xiàn)擬南芥AtTPS6除了參與調(diào)控抗旱及株型，還能夠調(diào)控植物的細(xì)胞形狀和表皮毛分枝[14]。

矮牽牛不但是園林中應(yīng)用較為廣泛的重要觀賞植物，同時由于矮牽牛再生容易，生活周期短，基因組已測序成功[15]，遺傳背景清晰，也是重要的模式植物。在矮牽牛栽培中，通常需要多次人工打頂促進側(cè)枝發(fā)育以達到花朵繁茂的觀賞效果，大大提高了生產(chǎn)成本，成為制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題。因此，培育多分枝且抗逆性強的矮牽牛新品種是解決矮牽牛高效生產(chǎn)的關(guān)鍵所在。本研究從矮牽牛中分離TPS6同源基因PhTPS6，并對基因的生物信息以及在不同組織、不同處理下的表達特性進行分析。以期為豐富海藻糖合成酶調(diào)控植物分枝發(fā)育及抗逆機理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以矮牽牛(P.hybridavar. Mitchell)為材料。矮牽牛材料種置于組織培養(yǎng)室中。光周期：16 h/8 h(光/暗)，溫度：25℃±2℃，光照度：3 500 lx。

1.2 PhTPS6的克隆

根據(jù)已公布的矮牽牛基因組序列(https://solgenomics.net/)，設(shè)計上游引物F:ATGGTGTCAAGATCCTATTCCAAT, 下游引物R:CTATAGAGGTAACATTTGCTCAGC。提取矮牽牛葉片RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板，使用上述引物克隆獲得PhTPS6序列，并使用高保真酶對全長序列進行校正。將膠回收產(chǎn)物直接送由上海生工生物工程公司進行測序。

圖1 海藻糖代謝[3]Fig.1 Trehalose metabolism[3]

1.3 PhTPS6的表達分析

分別取矮牽牛根、莖、葉、花、葉腋等部位，使用EZ-10總RNA小量提取試劑盒(上海生工生物工程有限公司)提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后用于檢測不同組織中基因的表達量；將矮牽牛去頂后分為2組：一組分別于6 h和24 h后取葉腋部位提取RNA，另一組去頂?shù)耐瑫r施加10 μL 50 μmol/L 3-吲哚乙酸(IAA，indole-3-acetic acid)，分別于6 h和24 h后取下方2～3個葉腋部位提取RNA，將提取的兩組RNA反轉(zhuǎn)錄后用于檢測去頂及IAA施加后基因的表達水平。該試驗以未去頂?shù)陌珷颗Ｗ鳛閷φ眨粚Π珷颗ｍ敹讼蛳碌牡?個葉腋部位施加10 μL 50 μmol/L 6-芐氨基嘌呤(6-BA)，分別于6 h和24 h后取葉腋提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后用于檢測6-BA處理后基因的表達水平。該試驗以未施加6-BA的矮牽牛作為對照；使用200 mmol/L的NaCl溶液澆灌矮牽牛，分別于12 h和24 h后取葉片提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后用于檢測鹽脅迫下基因的表達水平。該試驗中以正常澆水的矮牽牛作為對照；將矮牽牛置于8 ℃的光照培養(yǎng)箱中，分別于12 h和24 h后取葉片提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后用于檢測低溫脅迫下基因的表達水平。以上每個處理12棵苗，共進行3次生物學(xué)重復(fù)。反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR參照董麗麗等[16]的方法；熒光定量PCR引物為：PhTPS6-RT-F：GATGGCAGTAAAGGGTGGTT，PhTPS6-RT-R：GTCTTGCTCATTCGGGTGAA。使用Actin作為內(nèi)參基因。

1.4 生物信息分析

利用DNAMAN 6.0軟件，對不同物種的序列相似性進行比對。利用軟件Protparam tool(http://web.Expasy.org/protparam/)對蛋白質(zhì)的分子式、氨基酸組成等進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PhTPS6的克隆

根據(jù)已經(jīng)公布的腋花矮牽牛(P.axillaris)基因組序列，設(shè)計引物擴增獲得PhTPS6cDNA序列。該序列全長2 571 bp，編碼856個氨基酸。利用Expasy對PhTPS6蛋白序列進行分析，推測PhTPS6蛋白的分子式C4342H6838N1154O1276S48，該蛋白中相對含量較多的氨基酸是10.4% Leu、7.9% Ser、7.6% Val、7.2% Glu、6.2% Asp；總的帶負(fù)電荷的殘基(Asp+Glu)為115，總的帶正電荷的殘基(Arg+Lys)為98。將PhTPS6與苜蓿、馬鈴薯、胡楊的蛋白序列進行比對，序列相似性分別為83.68%、95.92%和87.03%(圖2)。

2.2PhTPS6的組織特異性表達分析

使用qRT-PCR對PhTPS6在莖、葉腋、葉片、根和花中的相對表達水平進行檢測。結(jié)果表明PhTPS6在被檢測的各個組織中均有表達。葉腋、莖和花中的表達量較高，而葉片中的表達水平最低，約為莖中的1/14(圖 3)。

2.3 生長素及細(xì)胞分裂素調(diào)控PhTPS6的表達

為研究生長素對PhTPS6基因的調(diào)控作用，分別對矮牽牛進行去頂以及去頂后施加IAA。結(jié)果顯示：相對于未去頂時，去頂6 hPhTPS6的表達水平上調(diào)約14倍。去頂24 h時，PhTPS6的表達水平顯著下降，約為未去頂植株的5倍(圖4-A)。而去頂后施加IAA 6 h后，PhTPS6表達水平約為完整植株中的2.7倍，顯著低于去頂6 h未施加IAA時的表達水平。在24 h時，PhTPS6表達水平下降至完整植株中的1.67倍，顯著低于去頂24 h未施加IAA時的水平(圖4-B)。為研究細(xì)胞分裂素對PhTPS6的調(diào)控，對矮牽牛葉腋部位施加6-BA，分別于6 h和24 h后對PhTPS6的表達水平進行檢測。結(jié)果表明：施加6-BA 6 h后，PhTPS6的表達水平上調(diào)約16倍，而24 h 時PhTPS6的表達水平下降為對照的水平(圖4-C)。

圖2 PhTPS6與其他物種的TPS6比對Fig.2 Alignment of PhTPS6 with other TPS6s

圖3 矮牽牛不同組織中PhTPS6的表達水平Fig.3 The expression level of PhTPS6 in different tissues of P.hybrida

A.去頂促進PhTPS6的表達 Decapitation up-regulated the expression ofPhTPS6；B.IAA抑制PhTPS6的表達 IAA repressed the expression ofPhTPS6；C. 6-BA促進PhTPS6的表達 6-BA up-regulated the expression ofPhTPS6；Dec.去頂 Decapitatation

圖4去頂、生長素及細(xì)胞分裂素對PhTPS6表達的調(diào)控
Fig.4TheexpressionofPhTPS6regulatedbydecapitatation,auxinandcytokinin

2.4 低溫及鹽脅迫誘導(dǎo)PhTPS6的表達

為研究低溫及鹽脅迫對PhTPS6的誘導(dǎo)，分別對矮牽牛進行低溫及NaCl脅迫處理。結(jié)果表明：低溫處理12 h后PhTPS6表達水平顯著上調(diào)，為對照的18.9倍，處理24 h時PhTPS6表達水平升高為對照的28.7倍。NaCl處理12 h后PhTPS6表達水平升高為對照的21.4倍，處理24 hPhTPS6表達水平升高為對照的30倍(圖5)。

圖5 低溫及鹽脅迫促進PhTPS6的表達Fig.5 The expression of PhTPS6 under low temperature and NaCl stress

3 討 論

本研究克隆獲得矮牽牛PhTPS6的全長序列。推測PhTPS6的氨基酸序列與苜蓿、馬鈴薯、胡楊等物種的序列相似性均在80%以上，說明PhTPS6是TPS6的同源基因。組織特異性表達分析顯示PhTPS6在莖、葉腋、葉片、根和花等多個組織中均有表達，這與擬南芥AtTPS6在多個組織中表達的結(jié)論相類似[14]，表明該基因可能在多個生長發(fā)育過程中起作用。PhTPS6在葉腋中的表達水平較高，預(yù)示PhTPS6可能在調(diào)控矮牽牛的分枝發(fā)育中具有重要作用。

去頂能夠移除生長素源，導(dǎo)致激素平衡被打破[17]。因此，去頂引起PhTPS6的表達水平的快速上調(diào)，一方面可能是生長素能夠抑制PhTPS6的表達。另一方面可能是PhTPS6蛋白能夠作為信號分子起作用，而去頂直接調(diào)控了PhTPS6基因的表達。隨著去頂時間的延長，PhTPS6的表達水平逐漸下降，說明PhTPS6可能在腋芽從休眠走向萌發(fā)的早期階段中起作用。去頂后施加IAA，則有效抑制了去頂所引起的PhTPS6表達水平的上升。進一步驗證了生長素能夠抑制PhTPS6的表達。

細(xì)胞分裂素在促進腋芽的萌發(fā)中具有直接作用[18]，施加6-BA 6 h后，PhTPS6的表達水平迅速上調(diào)，表明細(xì)胞分裂素能夠促進PhTPS6的表達。隨著處理時間的增加，PhTPS6的表達水平逐漸降低，并恢復(fù)為對照的表達水平。該研究進一步說明PhTPS6可能在促進腋芽萌發(fā)的早期階段具有重要作用。而生長素及細(xì)胞分裂素直接還是間接調(diào)控PhTPS6的表達有待于進一步研究。

植物在遭受逆境脅迫時，體內(nèi)海藻糖能夠迅速合成，以保護植物機體[19]。低溫處理12 h引起了PhTPS6表達水平的顯著上調(diào)，隨著處理的增加，PhTPS6表達水平呈上升趨勢。這與小麥中低溫能夠誘導(dǎo)TPS6的表達的結(jié)論相一致[20], NaCl處理后PhTPS6表達水平具有同樣趨勢。說明PhTPS6在矮牽牛對低溫及鹽脅迫的響應(yīng)中具有重要作用。

該研究為全面了解海藻糖合成基因PhTPS6在矮牽牛生長發(fā)育中的功能奠定了基礎(chǔ)，同時為后續(xù)獲得抗逆性強多分枝的矮牽牛新品種儲備了基因資源。