大花杓蘭根際與非根際土壤真菌多樣性的高通量測序分析

付亞娟，張江麗，侯曉強

(1.廊坊師范學院 生命科學學院，河北廊坊 065000；2.河北省高校食藥用菌應用技術研發中心，河北廊坊 065000)

大花杓蘭(CypripediummacranthumSw.)為蘭科杓蘭屬，是兼具觀賞價值和藥用價值的多年生草本植物[1]。近年來，商業性過度采挖及生存環境的破壞，大花杓蘭野生種群快速縮小，已被列為國家Ⅰ級瀕危保護植物。大花杓蘭也是典型菌根真菌植物，其種子萌發、植株生長發育都與菌根真菌密切相關[2]，但關于大花杓蘭菌根真菌的研究報道較少。張毓等[3]從野生大花杓蘭須根中分離到1株瘤菌根屬(Epulorhiza)真菌，并證實該真菌對大花杓蘭種子萌發有促進作用。Shimura等[4]對從大花杓蘭成株、幼苗及原球莖分離的瘤菌根真菌進行促萌發試驗，發現來自成株的菌根真菌較幼苗及原球莖，具有更高的促萌發率。張亞平[5]研究發現，雞油菌目(Cantharellales)真菌能顯著地促進大花杓蘭原球莖的生長和發育。目前，由于大花杓蘭菌根真菌在實驗室培養條件下不易分離培養、加上大花杓蘭組培技術瓶頸尚未完全突破，很大程度上制約了大花杓蘭的保育進程。

根際土壤真菌是土壤-植物生態系統的重要組成部分，真菌群落的組成及豐度與植物生長發育、土傳病害的發生發展密切相關[6]。因而植物根際土壤真菌群落多樣性及生態功能已成為微生物分子生態學研究的熱點。相對于傳統培養方法，克隆文庫技術可以避免非培養微生物所帶來的誤差，但仍有一定的局限性，它僅能反映出樣品中少數優勢菌群信息。近年來，隨著測序技術的迅猛發展，高通量測序技術能夠對環境微生物進行高覆蓋率、高深度測序，深入挖掘樣本中的信息。最新研究表明，蘭科菌根真菌主要分布在宿主植物成株周圍土壤，且菌根真菌相對豐度隨距蘭科植物地理距離增加而遞減[7-8]。大花杓蘭作為蘭科瀕危藥用植物，其根際土壤真菌多樣性的研究目前尚未見報道。因此，本研究采用Illumina Miseq高通量測序技術，對大花杓蘭根際、非根際土壤真菌群落組成的多態性進行對比分析，旨在為將來分離篩選大花杓蘭共生菌根真菌及開展大花杓蘭保育研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

土壤樣品于2016年6月采自北京百花山國家級自然保護區(東經115°25′～115°42′，北緯39°48′～40°05′)海拔約1 700 m的高山草甸。該地屬于溫帶大陸性季風氣候，全年平均氣溫在6～7 ℃，最熱月是7月份，平均溫度22 ℃；最冷月是1月份，平均溫度-5.7 ℃。年降水量在450～720 mm，全年降水量的74%多集中在6、7、8三個月。

本研究采集的大花杓蘭根際與非根際土壤樣本為亞高山草甸土，土壤pH 6.8，主要植被為大花杓蘭、手參、鈴蘭、藜蘆及各種野生花卉等。大花杓蘭為國家Ⅰ級瀕危保護植物，主要分布于百花山草甸，其總數目約100余株，多數以2～5株成叢分布，少數為單株，極少數為5～10株叢生。大花杓蘭具1花，花色為紫色，花期6～7月，果期8～9月。基于對大花杓蘭的保護，本研究將采自大花杓蘭須根系表面0～1 cm范圍內5～15 cm土層的土壤視為根際土壤，而非根際土壤樣品為距離大花杓蘭須根系表面5～10 cm范圍內5～15 cm土層的土壤。隨機選取3個樣點，多點采集的根際土和非根際土充分混合后，置于無菌自封袋中，命名為XF1(根際土)和XF2(非根際土)。當天將土壤樣本帶回實驗室，過2 mm篩后，置于-80 ℃冰箱中保存，備用。

1.2 土壤宏基因組DNA的提取

采用土壤DNA提取試劑盒(FastDNA SPIN Kit for Soil，USA)分離土壤總DNA，其操作按照試劑盒說明書進行。采用7 g/L瓊脂糖凝膠電泳對土壤DNA的完整性進行檢測，Nanodrop 2000對DNA的濃度及純度進行檢測。

1.3 土壤真菌ITS序列的PCR擴增

采用真菌通用引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)對根際與非根際土壤真菌核糖體基因ITS1-ITS2間隔區進行PCR擴增。PCR反應體系(50 μL)：土壤基因組DNA 2 μL，引物對ITS1F和ITS2R(10 μmol/L)各1.5 μL，Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 1 μL，High GC Enhancer 10 μL，5X Q5 Reaction Buffer 10 μL，dNTPs(10 mmol/L)1 μL，無菌ddH2O補足至50 μL。PCR擴增程序如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃最后延伸7 min。每個樣品做3次重復PCR，18 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將同一樣品3次PCR產物進行混合并通過磁珠法DNA凝膠回收試劑盒(上海生工)對目標條帶進行割膠回收。純化后的PCR產物送北京百邁克生物科技有限公司進行Illumina Miseq高通量測序。

1.4 優質序列的獲取

采用FLASH軟件[9]對原始測序數據進行拼接，而后用Trimmomatic軟件[10]對拼接序列進行質量過濾，最后使用UCHIME[11]程序去除嵌合體序列。

1.5 數據分析

采用UCLUST[12]德爾方法，在相似性≥97%的水平上對優質序列進行操作分類單元(operation taxonomic units，OTUs)聚類分析，并過濾OTUs(0.005%作為閾值)，篩選出OTUs的代表性序列；基于UNITE數據庫，對OTUs代表序列進行物種注釋分析(置信度閾值為0.8)，獲得每個OTU的分類學信息并構建稀釋性曲線。利用QIIME軟件[13]計算Alpha多樣性指數，包括豐富度指數Chao1、多樣性指數Shannon、Simpson指數和ACE指數。利用R語言繪制大花杓蘭根際與非根際土壤真菌OTU-Venn圖。

2 結果與分析

2.1 測序結果質量分析

通過對大花杓蘭根際與非根際2個土壤樣品進行高通量測序，共獲得179 996對Reads，雙端Reads拼接及過濾后得到111 874條Clean tags，其中大花杓蘭根際土壤63 780條Clean tags，非根際土壤48 094條Clean tags。基于≥97%的相似度水平，通過聚類共獲得1 223個用于物種分類的OTUs，根際和非根際土壤真菌OTUs數量分別為1 004和945。稀釋性曲線(Rarefaction curve)可以用來說明樣本的測序數據量是否合理，也可以用來比較測序數據量不同的樣本中物種的豐富度。大花杓蘭根際與非根際土壤真菌群落稀釋性曲線如圖1所示，測序數據量達到20 000時，兩樣本真菌OTUs數量均趨向平坦，表明樣本的測序深度基本合理，能夠比較真實、全面地反映自然條件下土壤樣本真菌群落結構的組成。

2.2 根際與非根際土壤樣本中真菌多樣性及相關性分析

Alpha多樣性是指一個特定區域或生態系統內的多樣性。多樣性指數是反映豐富度和均勻度的綜合指標。兩土壤樣本的群落豐富度指數Chao1、ACE和群落多樣性的指數Shannon和Simpson見表1。如表1所示，Chao1和ACE指數在大花杓蘭根際土壤中的平均值分別為1 036.00和1 024.04，而非根際土壤樣本中的平均值分別為972.72和957.07，說明根際土壤中真菌群落的豐富度較高。根際土壤樣本的Shannon指數(5.27)高于非根際土壤Shannon指數(4.82)，而根際土壤樣本Simpson指數(0.023)低于非根際土壤(0.042)，說明根際土壤真菌群落多樣性高于非根際土壤。因此，綜合OTU數量及α多樣性指數結果，發現大花杓蘭根際土壤真菌群落在豐富度和多樣性上均高于其非根際土壤。另外，OTUs-Venn圖可以直觀反映樣本間相同和各自獨特的OTUs。大花杓蘭根際土壤(XF1)與非根際土壤(XF2)真菌OTUs-Venn圖如圖2所示，2個土壤樣本XF1和XF2共獲得1 223個OTU，它們之間共有的OTU數量為726，XF1特有OTU數量為278，XF2特有OTU數量219。因此，綜合α多樣性指數及OTUs-Venn圖，發現大花杓蘭根際與非根際土壤真菌組成均較為豐富，但它們在真菌組成、結構及相對豐度上存在一定的差異。

XF1.大花杓蘭根際土壤樣本 XF1 represents rhizospheric soil sample ofC.macranthum；XF2.大花杓蘭非根際土壤樣本 XF2 represents non-rhizospheric soil sample ofC.macranthum

圖1 根際與非根際土壤樣品稀釋曲線(相似度水平為97%)Fig.1 Rarefaction curves of rhizospheric and non-rhizospheric soil samples at cutoff level of 3%

圖2 大花杓蘭根際與非根際土壤真菌OTUs分布Venn圖Fig.2 OTUs-Venn graph of rhizospheric and non-rhizospheric soil samples

2.3 大花杓蘭根際與非根際土壤真菌組成分析

通過Illumina Miseq高通量測序發現，大花杓蘭根際與非根際2個土壤樣本中共檢測到的真菌涉及5個門，分別是子囊菌門(Ascomycota)、接合菌門(Zygomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和球囊菌門(Glomeromycota)，各個真菌門所占比例見表2。從表2可知，大花杓蘭根際與非根際土壤真菌的優勢類群均為子囊菌門，其次是接合菌門。根際土壤擔子菌門真菌數量占18.72%，高于非根際土壤2.43倍。另外，根際與非根際土壤真菌類群中，壺菌門和球囊菌門真菌的相對豐度均較低，而未知真菌也占很大的比例(約16%～24%)。

從綱、目、科、屬水平上進行分析，發現大花杓蘭根際與非根際土壤樣本真菌在群落組成和豐度上存在差異(圖3)。對于大花杓蘭根際土壤，在Ascomycota門真菌中，Dothideomycetes是第一大綱，占該門的12.82%，其次是Sordariomycetes綱，占10.30%，再次是Leotiomycetes綱，占5.05%。在Basidiomycota門中，優勢類群為Agaricomycetes綱，占16.12%，其次Tremellomycetes綱，占2.27%。Dothideomycetes綱主要包括Pleosporales和Capnodiales 2個目，分別占該綱的6.85%和4.83%。在Agaricomycetes綱中，Agaricales目和Cantharellales目分別占該綱的14%和1.27%。從“科”這一分類層面來看，Mycenaceae科為優勢類群，相對豐度為7.04%，遠遠高于非根際土壤的相對豐度(0.1%)，其次是Hygrophoraceae科、Chaetomiaceae科和Lasiosphaeriaceae科等，相對豐度分別為5.46%、3.44%和2.88%等。另外，Ceratobasidiaceae科占1.12%，高于非根際土壤11.2倍。在根際土壤中Tulasnellaceae科豐度較低，僅為0.03%，但在非根際土壤未發現膠膜菌科真菌。從屬的水平進行分析，發現大花杓蘭根際土壤中豐度顯著增加的真菌群落主要為Mycena屬、Hygrocybe屬、Humicola屬、Cryptococcus屬、Antarctomyces屬、Davidiella屬和Apodus屬，其中Mycena屬的平均比率為7.04%，高于非根際土壤Mycena的70.4倍。另外，根際土壤測序分析發現4個蘭科菌根真菌Ceratobasidium屬，Rhizoctonia屬，Epulorhiza屬和Thanatephorus屬豐度較低，均小于1.0%，但Ceratobasidium屬在測序總數中占的比率超過非根際土壤的17.27倍，Thanatephorus屬真菌高于非根際土壤2.71倍，而Rhizoctonia屬和Epulorhiza屬在非根際土壤中未發現。

表2 兩土壤樣本真菌群落在門分類水平上的組成及相對豐度Table 2 Relative abundances and composition of fungi taxa at the phylum level between two soil samples %

XFI.大花杓蘭根際土壤真菌 XFI represents rhizospheric soil fungi taxa；XF2.大花杓蘭非根際土壤真菌 XF2 represents non-rhizospheric soil fungi taxa

圖3兩土壤樣本真菌群落的相對豐度
Fig.3Relativeabundancesoffungitaxafromtwosoilsamplesanalyzedwithhighthroughtputsequencing

非根際土壤的Ascomycota門真菌中，其優勢類群為Sordariomycetes綱，占9.39%，其次為Dothideomycetes綱，占8.18%，再次是Leotiomycetes綱，占6.17%。在Basidiomycota門中，Agaricomycetes是第一大綱，占該門的5.35%；其次為Tremellomycetes綱，占1.89%。Sordariomycetes綱主要包括Sordariales目和Hypocreales目，分別占該綱的3.98%和3.47%。在Agaricomycetes綱中，Agaricales目占該綱的3.61%，比根際土壤低3.87倍；Cantharellales目占0.46%，低于根際土壤的2.76倍；Polyporales目占1.13%，而在根際土壤未發現此目真菌。從“科”這一分類層面來看，平均豐度大于1%的科有Hygrophoraceae科(3.11%)、Chaetomiaceae科(2.96%)、Herpotrichiellaceae科(2.10%)、Davidiellaceae科(1.53%)、Mycosphaerellaceae科(1.24%)和Leptosphaeriaceae科(1.21%)。從“屬”的水平進行分析，發現大花杓蘭非根際土壤中豐度顯著增加的真菌群落主要為Geomyces屬(2.53%)、Chaetomium屬(1.92%)，Phlebiella屬(1.13%)、Ilyonectria屬(1.06%)。其中Phlebiella屬在根際土壤中未檢測到。

3 討 論

根際微生物對植物種子萌發、生長發育和抑制土傳病害具有較好的正效應[14]，研究瀕危蘭科藥用植物大花杓蘭根際微生物群落的組成及多樣性對于大花杓蘭的保育具有重要意義。本研究采用Illumina Miseq高通量測序技術對大花杓蘭根際與非根際土壤的真菌群落多樣性進行對比分析，其結果為大花杓蘭菌根真菌的研究奠定理論基礎。基于97%相似度水平，根際與非根際2個土壤樣本通過聚類分別被劃分為1 004和945個OTUs。大花杓蘭根際土壤樣本的Chao1和Shannon指數值均大于非根際土壤樣本，表明根際土壤真菌群落在豐富度和多樣性上均高于其非根際土壤。從門水平上來看，大花杓蘭根際與非根際土壤中真菌優勢菌群依次為子囊菌、接合菌和擔子菌，其中子囊菌在2個土壤樣本中均占絕對優勢，平均比率為43.6%和44.40%。徐紅梅等[15]對杭白芍、李倩等[16]對黃花蒿、李越鯤等[17]對枸杞根際土壤真菌優勢菌群的研究中也得到了相似的結果。為什么子囊菌在很多植物根際中所占比例最大？其原因可能是自然界中許多子囊菌無性繁殖能力很強，能產生大量的分生孢子，快速增長，使其在數量上明顯占有優勢[18]。

Oja等[19]對二葉舌唇蘭(Platantherachlorantha)、四裂紅門蘭(Orchismilitaris)及它們周圍土壤中的蘭科菌根真菌進行研究，發現蠟殼耳目Sebacinales、膠膜菌科Tulasnellaceae和角單菌科Ceratobasidiaceae，也同樣存在于蘭科植物的根中，只是相對豐度不同。Waud等[8]研究發現，與蘭科植物共生的菌根真菌廣泛分布于土壤中，但菌根真菌群落組成的變化與近端宿主植物密切相關。Voyron等[20]的研究結果表明，蘭科植物Ophryssphegodes和Anacamptismoriog根中某些菌根真菌優勢類群在土壤呈零星分布或未被檢測到。與非根際土壤相比，本研究發現大花杓蘭根際土壤豐度顯著增加的真菌類群為擔子菌門、傘菌綱、傘菌目和雞油菌目、小菇科和角擔菌科、小菇屬和角擔菌屬。除了占優勢地位小菇屬和角擔菌屬真菌外，大花杓蘭根際土壤還發現了Epulorhiza屬，Rhizoctonia屬，Thanatephorus屬真菌類群的存在，但相對豐度均較低。其中Thanatephorus屬真菌占0.13%，高于非根際土壤2.71倍；而Rhizoctonia屬和Epulorhiza屬真菌平均比率為0.03%，但在非根際土壤中均未發現。盡管這些真菌都是已報道的不同蘭科植物的菌根真菌[3-5, 21]，但它們是否為大花杓蘭的菌根真菌，還需進一步分離培養這些真菌并對其生態功能進行驗證。

此外，被孢霉屬真菌在大花杓蘭根際與非根際土壤均占有絕對優勢，其占比平均值分別為20.30%和22.31%，這與一些已有研究結果相一致[22-23]。被孢霉屬真菌是土壤中較為常見真菌，具有一定的生態功能，能促進植物根系吸收礦質元素、抑制病原菌等[24]，但被孢霉屬真菌對大花杓蘭生長發育的作用尚未知，有待研究。在根際與非根際土壤真菌類群中，Unclassified真菌均占有較大的比例，這表明大花杓蘭根際與非根際土壤中存在大量的真菌新類群，有待于進一步發掘。

4 結 論

本研究采用Illumina Miseq高通量測序技術對瀕危蘭科植物大花杓蘭根際與非根際土壤真菌群落組成進行對比分析，發現大花杓蘭根際與非根際土壤真菌組成均較為豐富，但真菌組成結構及相對豐度存在一定的差異。與非根際土壤相比，在門、綱、目、科和屬分類水平上豐度顯著增加的根際土壤真菌類群分別為擔子菌門Basidiomycota、傘菌綱Agaricomycetes、傘菌目Agaricales和雞油菌目Cantharellales、小菇科Mycenaceae和角擔菌科Ceratobasidiaceae、小菇屬Mycena和角擔菌屬Ceratobasidium。