干旱誘導的海藻糖和脫落酸對蘋果品質的影響

孫漢青，陶紅霞，宋雪娜，郭延平，趙政陽

(西北農林科技大學 園藝學院，陜西楊凌 712100)

干旱是影響農業生產的重要環境因子之一。在中國西北地區，由于水資源缺乏，春旱、伏旱現象嚴重，會影響蘋果樹的正常生長發育，導致果實品質下降。有研究發現，適度干旱能夠導致碳水化合物質量分數增加，但其與碳信號之間的相互作用關系仍然不清楚[1]。

蘋果果實中含有的糖類主要是淀粉、蔗糖、果糖、葡萄糖和少量的山梨醇，其中除淀粉外均為可溶性糖，可溶性糖中以果糖最甜。果實風味及品質會受到果實總糖水平及果糖與葡萄糖的比值(F/G)的影響[2]。在蘋果等薔薇科植物中，山梨醇是光合產物運輸的主要形式[3]，蘋果韌皮部中，轉運過程中的碳水化合物中山梨醇占80%[4]，起著其他植物中蔗糖的作用。

海藻糖(α-D-glucopyranosyl-1,1-α-D-glucopyranoside)是由2個葡萄糖分子組成的雙糖，是一種安全、可靠的天然糖類，為非還原性糖，是糖類物質中性質最穩定的雙糖之一[5]。海藻糖代謝途徑包括：尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和6-磷酸葡萄糖(G-6-P)在6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)的作用下生成6-磷酸海藻糖(T6P)，T6P在6-磷酸海藻糖磷酸酯酶(TPP)的作用下生成海藻糖，海藻糖在海藻糖酶(TRE)的作用下分解為葡萄糖[6]。海藻糖有調節生物合成的功能，因為海藻糖可以修飾蛋白激酶，與14-3-3蛋白相互作用，從而參與它們的信號分子功能[7]。也有研究表明，海藻糖前體T6P在植物生長發育中被作為一個重要的信號分子可以影響植物生長及對碳的利用，在糖代謝過程中起重要的調節作用[8]。T6P與蔗糖非酵解蛋白激酶1(SnRK1)能協同調節植物的生長與發育[9]，當碳源缺乏時，植物體內T6P質量分數會減少，隨后SnRK1活性增加，進而降低植物碳源消耗，增加碳同化進程和光合作用，最終使植物體內積累大量碳水化合物[10]。SnRK1是蔗糖非發酵(sucrose non-fermenting,SNF)相關的腺苷-磷酸蛋白激酶[adenosine 5’-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK]家族中的一員，是調控細胞響應內源能量及碳狀態的中樞[11]，在T6P抑制SnRK1活性后，會進而影響bZIP11啟動子調控相關基因表達[12]。bZIP在植物發育和代謝過程中起關鍵性調控作用，主要功能是調節基因表達的強度，或應答外源激素和環境的脅迫[如參與植物對脫落酸(ABA)、光等發育中各種信號的反應][13]。植物遭遇鹽、干旱或低溫等非生物脅迫時，會產生ABA同時激活ABA依賴途徑和ABA非依賴途徑2種信號傳導通路[14]，參與ABA依賴途徑的基因不僅誘導ABA的生物合成，而且調節含有ABA響應元件(ABRE元件)的基因的表達。bZIP轉錄因子家族中的A亞族可以與ABRE元件結合[13]。

為了探討在適度干旱條件下，蘋果果實品質的提升與海藻糖及ABA在糖代謝途徑中的共同調節作用關系。本試驗主要研究在適度水分脅迫下，蘋果果實風味及品質發生改變的過程中，海藻糖與ABA在其中的作用，為探究適度干旱條件下果實品質提升的原因提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在西北農林科技大學北園藝場(34°20′N，108°24′E)進行，試材為7～8 a生的盆栽嘎啦Gala/M26蘋果樹。

1.2 試驗方法

2016年3月選取生長狀況基本一致且無病蟲害的植株，栽于盆高50 cm×直徑60 cm的塑料盆中，基質選用園地表層土壤、有機肥與種植基質混合而成，有機質的質量分數為5%，每盆基質約100 kg，栽后保持水分充足，并預防病蟲害的發生。

處理1(干旱脅迫)：花后100 d，即7月15日開始用土壤烘干法控水，分別為田間最大持水量的75%～80%(CK1)、60%～65%(A)、50%～55%(B)，每株為1個重復，重復6次，每隔7～9 d采1次樣，共5次。

采用土壤烘干法控制土壤水分：每天從盆中不同方位20 cm深處取土帶回實驗室，測定濕土及烘干后土質量，計算公式如下：田間持水量=(濕土質量-干土質量)/干土質量，根據所需控水程度補充定量水分。

處理2(外源ABA處理)：最佳采收期前20 d，即7月24日選取果型端正，生長狀況一致無病蟲害的100個果實，用醫用注射器將配置好的ABA溶液和蒸餾水從蘋果果實萼端中心口注入果實氣腔內，以沒有機械損傷為成功，分為2個梯度，0(蒸餾水)(CK2)和1 mmol/L(ABA)，每個果實為1次重復，重復6次，3～4 d采1次樣，共5次。

1.3 測定項目及方法

將果實分為兩份，一份用來測定品質指標，單果質量、橫縱徑、色度等外觀品質，內在品質測定可滴定酸、可溶性固形物、硬度等；另一份用蒸餾水清洗后，將果實切塊，用錫箔紙包裹置于液氮中帶回實驗室，存放于―80 ℃冰箱，用以測定葡萄糖、果糖、蔗糖、山梨醇、海藻糖的質量分數和相關酶活性及內源ABA質量分數。

1.3.1 果實品質指標 用萬分之一分析天平測單果質量，電子數顯卡尺guanglu牌，分辨率為0.01 mm的游標卡尺，測縱橫徑，果形指數為果實縱徑與橫徑比值。用CR-400色度計測定果皮色度，L*表示亮度，a*表示紅綠色度，b*表示黃藍色度。取勻漿用PAL-BX迷你數顯折射計測可滴定酸和可溶性固形物，削皮后使用果實硬度計GY-J測果實硬度。

果實含水量：分別測定果實鮮質量(m1)；將果實置于65 ℃烘箱中烘8 h，取出冷卻至室溫，稱此時的質量，再烘1 h后，取出冷卻至室溫再次稱量，重復以上步驟，直到恒量即為果實干質量(m2)，果實含水量=(m1-m2)/m1×100%。

1.3.2 可溶性糖質量分數 參照梁俊等[15]的提取方法及測定方法，并加以改進。具體為：準確稱取1 g果實凍樣，加入3 mL 超純水，80 ℃水浴超聲波提取30 min，重復3次，10 000 g離心10 min，合并上清液，用0.45 μm濾膜過濾待測。利用高效液相色譜(HPLC)測定4種可溶性糖，果糖、葡萄糖、山梨醇和蔗糖。色譜條件為-Sugar-PakTMI(Waters)色譜柱，柱溫80 ℃，檢測器為示差折光檢測器(Waters 410)，流動相為超V(純水)∶V(甲醇)=200∶1。

1.3.2 海藻糖質量分數 果實中海藻糖質量分數的測定參考Garg等[16]的方法，并適當改變。具體為：準確稱取凍干樣1 g，用3 mLφ= 85%乙醇75 ℃超聲提取海藻糖30 min，13 000 g離心15 min取上清液，沉淀再加3 mL乙醇重新提取，最后上清混合，樣品烘干，加1 mL蒸餾水復溶，用0.45 μm濾膜過濾待測。加入海藻糖酶將海藻糖分解為2分子葡萄糖，用葡萄糖試劑盒Sigma Glucose(HK)Assay Kit測定葡萄糖質量分數。

1.3.3 TPS和TPP活性 參考Ilhan 等[17]的方法并加以改進。酶液提取：液氮速冷果肉研磨成粉末于―80 ℃貯存。提取時，稱取0.5 g果肉粉末加入2 mL 50 mmol/L 氨丁三醇-鹽酸(pH7.5)(Tris-HCl)緩沖液，其中含100 mmol/L NaCl,100 mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)和100 mmol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF)，置研缽于4 ℃下研磨。13 000 g 以下離心5 min，上清液于4 ℃下存貯，用于酶活測定。

TPS活性：反應體系包括50 mmol/L N-三(羥甲基)甲基甘氨酸緩沖液(pH 7.0)(tricine)，10 mmol/L 6磷酸葡萄糖，5 mmol/L 尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和12.5 mmol/L MgCl2，加入酶液后共0.4 mL，35 ℃下孵育30 min后，沸水浴5 min停止反應；第2個反應取上清液加140 mmol/L tricine(pH 7.6)，2 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸，0.31 mmol/L 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原態(NADH)和5U乳酸脫氫酶，加入5 U丙酮酸激酶后開始反應，用紫外分光光度計在340 nm處測定計算釋放尿苷二磷酸(UDP)質量分數，用單位時間內釋放的UDP質量分數表示TPS活性。

TPP活性：反應體系包括1 mmol/L 6-磷酸海藻糖，10 mmol/L MgCl2，50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)加入酶液共2.5 mL體系，于37 ℃ 孵育30 min，沸水浴5 min停止反應；反應生成海藻糖，加入海藻糖酶后用葡萄糖試劑盒Sigma Glucose(HK)Assay Kit測定生成葡萄糖質量分數代表TPP活性。

1.3.4 TRE活性 參考Lopez等[18]的方法并加以改進。酶液提取：稱取0.3 g果肉粉末，加入2 mL提取液[100 mmol/L 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸-氫氧化鉀(pH 6.3)(MES-KOH)含2 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)和2 mmol/L 交聯聚維酮(PMSF)]并加適量PVPP研磨成勻漿，13 000 g 4 ℃以下離心5 min，取上清液用于酶活測定。

TRE活性：反應體系中酶液加入100 mmol/L 海藻糖，50 mmol/L MES-KOH(pH 6.3)緩沖液共0.6 mL，37 ℃孵育45 min后沸水浴5 min，反應生成的葡萄糖利用葡萄糖試劑盒(同上)測定生成葡萄糖表示海藻糖酶活性。

1.3.5 果實內源ABA質量分數 ABA提取參考楊方威[19]的方法：稱取樣品1 g，在冰浴下研磨成漿，加入φ=70%冷丙酮20 mL，保鮮膜密封，在4 ℃冰箱里冷浸過夜。離心分離，浸提液轉入150 mL燒瓶中，加10 mL丙酮潤洗離心管離心分離后與浸提液合并，40 ℃減壓蒸發至沒有丙酮殘留，剩余水相完全移到三角瓶中，用30 mL石油醚萃取脫色2次，棄去醚層，水相調pH至3.0，用乙酸乙酯萃取3次，每次10 mL，收集酯相。水相調pH至8.0，再用乙酸乙酯萃取3次，每次10 mL，合并酯相，在40 ℃下減壓蒸干。流動相定容至10 mL，用0.22 μm超微有機濾膜過濾，濾液即可作為樣品液，進行高效液相色譜測定。色譜柱：XR-ODS 1.6 μm(2.0 mm×75 mm Column)；以甲醇和φ=0.1%冰乙酸溶液體積比28∶72為流動相，測定樣品中ABA質量分數。

1.4 數據分析

用WPS Excel 2010對試驗數據進行處理，結果以“平均值±標準誤”表示，結合SPSS 21.0軟件進行方差分析，多個數據間差異顯著性檢驗用新復極差法，2個數據間差異顯著性檢驗用t檢驗，用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 干旱處理對蘋果品質性狀的影響

表1結果顯示，在花后100 d開始干旱脅迫后，單果質量受到一定影響，干旱程度越強，單果質量顯著下降，處理B條件下下降顯著，處理A輕度干旱條件下較對照組單果質量有所下降，但并不顯著。然而果實相對含水量并沒有隨干旱程度的加深而改變，果形指數也無顯著變化。

表1 采收期不同程度水分脅迫條件下果實的品質性狀Table 1 Fruit quality under different drought stresses during harvest time

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters in the same column indicate significant difference(P<0.05).

果實色度只有a*值隨干旱程度的加深而降低，說明果皮紅綠的變化受水分脅迫影響較大。果實硬度和可滴定酸在果實受到干旱脅迫后顯著下降，可溶性固形物則顯著升高，然而不同程度的控水處理間并無顯著差異。

2.2 干旱和注果處理對果實糖分積累的影響

進入果實成熟期，果實中蔗糖處于緩慢積累過程中(圖1-A)；果實成熟前期水分脅迫顯著促進蔗糖的積累，從花后125 d開始則顯著抑制蔗糖的積累，說明成熟前期干旱促進了蔗糖的積累，后期則抑制蔗糖積累。在外源ABA處理的果實中，蔗糖的積累表現近乎相同的過程，但其中抑制蔗糖積累發生在花后125 d。蔗糖的抑制發生在干旱后20 d，外源ABA處理后8 d，說明蔗糖的積累對ABA質量分數更加敏感。

蘋果果實中葡萄糖質量分數的積累受水分脅迫條件的影響而顯著增加(圖1-B)，并且在花后110 d顯著變化，水分脅迫程度越深，越能促進葡萄糖的積累，說明水分脅迫能促進成熟期果實葡萄糖的積累。在外源注射ABA的試驗中，葡萄糖質量分數在花后122 d顯著增加，這和干旱處理結果一致。

山梨醇的質量分數隨果實進入成熟期而逐漸升高(圖1-C)，干旱處理后山梨醇質量分數顯著增加，其中處理B山梨醇積累更加明顯，這說明干旱可以提高山梨醇在果實中的質量分數。外源注射ABA的果實中，相對于對照組果實山梨醇質量分數顯著升高，說明ABA能促進山梨醇的積累。

通過圖1-D可以看出，干旱處理后果糖質量分數相對于水分充足條件下顯著增加，并且水分虧缺程度越大，果糖質量分數增加越顯著，說明干旱有利于果糖的積累。外源注射ABA后，果實中果糖質量分數也顯著增加，這與干旱處理下的果糖質量分數變化是一致的，說明干旱條件下產生ABA能促進果糖的積累。海藻糖相比其他糖來說質量分數很低，并且在成熟期海藻糖質量分數波動不大(圖1-E)。在干旱條件下，海藻糖質量分數比水分充足時顯著升高，其中處理B中度脅迫條件下海藻糖質量分數增加的更為顯著，說明干旱有利于海藻糖的積累。在注果試驗中，注果之前海藻糖質量分數幾乎持平，注果后海藻糖質量分數顯著增加，這與干旱處理結果保持一致，說明ABA有利于海藻糖在果實中的積累。

2.3 干旱和注果處理對果實內源ABA質量分數的影響

由圖2可知，注果后果實中ABA質量分數顯著增加，外源添加ABA后促進了內源ABA的積累；干旱處理后內源ABA質量分數顯著增加，最高可達正常情況的2倍。說明干旱處理和外源添加脫落酸對果實內源ABA的影響是一致的。

2.4 干旱和注果處理對果實中海藻糖代謝相關酶活性的影響

圖3-A中，干旱處理花后118 d，TPS活性逐漸增加，但不同處理間無顯著差別，到花后125 d后，經過干旱處理過的果實TPS活性顯著增加，干旱程度越大酶活性增加越多，說明干旱可以促進TPS的催化功能。圖3-B可以看出，外源添加脫落酸后， 花后129 d后TPS活性開始顯著增加，說明ABA對TPS活性也有相同的作用。因為干旱可以促進果實中ABA的積累，所以可以推測果實中TPS活性的改變是因為干旱誘導了內源ABA的產生而變化的。

由圖4-A可以發現TPP活性對水分脅迫十分敏感，開始控水后TPP活性開始顯著增加，并且水分脅迫越嚴重，TPP活性增加越顯著，圖4-B中外源添加ABA后TPP活性同樣顯著增加，可以推測出：干旱后植物產生的脫落酸可能是影響TPP活性變化的重要因素。TPP活性越大越有利于海藻糖的形成，這也與圖1-I和圖1-J海藻糖質量分數的增加結果一致。

TRE催化海藻糖分解成葡萄糖，是植物體中海藻糖降解的重要途徑，圖5-A中花后118 d后TRE活性顯著降低，并且水分缺少越嚴重的TRE活性下降的越顯著。圖5-B顯示外源添加脫落酸后TRE活性也在花后125 d后開始顯著下降。說明干旱條件下植物產生的脫落酸會導致TRE活性的降低，抑制海藻糖的分解。

從海藻糖質量分數與海藻糖代謝相關酶活性變化來看，在干旱脅迫下海藻糖質量分數與TPS、TPP活性呈正相關關系，尤其與TPP幾乎在干旱脅迫后同一時間段受到了影響。與TRE則呈負相關關系。因此有利于海藻糖在干旱條件下積累。外源添加ABA后，內源ABA質量分數與TPS、TPP活性呈正相關的關系而與TRE則呈負相關，這與干旱條件下對海藻糖代謝酶的影響是一致的。

不同小寫字母表示同一處理不同時期呈顯著相關(P<0.01) Different lowercase letters show significant correlation among different periods(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05) Indicates significant difference (P<0.05) ，**表示差異極顯著 Indicates significant difference (P<0.01)

圖1不同程度水分脅迫和外源添加ABA處理對蘋果果實蔗糖、葡萄糖、山梨醇、果糖和海藻糖質量分數的影響
Fig.1EffectsofdroughtstressandexogenousABAtreatmentonapplesucrose,glucose,sorbitolfructoseandtrehalosemassfractions

圖2 不同程度水分脅迫和外源添加ABA處理對蘋果果實內源脫落酸質量分數的影響Fig.2 Effects of drought stress and exogenous ABA treatment on apple endogenous ABA mass fraction

圖3 不同程度水分脅迫和外源添加ABA處理對蘋果果實TPS活性的影響Fig.3 Effects of drought stress and exogenous ABA treatment on apple TPS activity

圖4 不同程度水分脅迫和外源添加ABA處理對蘋果果實TPP活性的影響Fig.4 Effects of drought stress and exogenous ABA treatment on apple TPP activity

3 討論與結論

當植物受到干旱脅迫時根系會產生脫落酸并通過木質部從根輸送到地上部[20]，在植物遇到非生物脅迫時提高植物的抗性。而海藻糖已被證明在高等植物體中存在，可以作為滲透調節物質幫助植物抵抗逆境[21]，研究表明，一些耐旱生物在遇到脅迫環境時，生物體中海藻糖質量分數會增加[22]，海藻糖具有很強的抗脫水作用，因此海藻糖可以在干旱、寒冷以及高鹽堿等逆境條件下保護生物膜及蛋白質免受傷害[23]。

在本試驗中，通過干旱處理和外源添加脫落酸，希望為干旱條件下蘋果果實中糖質量分數升高，品質提升提供新的研究思路。進行比較后發現，2種處理均造成了果實中脫落酸質量分數的增加，這樣的結果為探究脫落酸在干旱脅迫條件下對海藻糖代謝途徑的影響提供了可能性。

圖5 不同程度水分脅迫和外源添加ABA處理對蘋果果實內TRE活性的影響Fig.5 Effects of drought stress and exogenous ABA treatment on apple TRE enzyme activity

本試驗發現不僅是干旱條件下海藻糖質量分數會顯著增加，外源增加ABA后海藻糖質量分數也顯著提高，因此可以推測ABA可以促進海藻糖的積累。有研究發現：在干旱條件下，柳枝黍中海藻糖和ABA質量分數均會顯著上升[24]，在水稻的研究中也發現，ABA可以誘導miR162b來增加水稻的抗旱性，而miR162b的目標基因為OsTRE1，從而抑制了OsTRE1的表達[25]。在本研究中還發現，增加外源ABA后，抑制海藻糖酶的活性，減少海藻糖的分解，同時促進TPP、TPS活性，TPS催化UDPG和G6P反應合成T6P，TPP又將T6P脫磷酸形成海藻糖，酶活性的變化最終使果實中海藻糖質量分數顯著增加，所以干旱條件下果實內海藻糖質量分數的升高與內源脫落酸質量分數的升高存在密切聯系，這與Ilhan等[17]的研究結果一致。

有研究表明：海藻糖調節著糖代謝的途徑，海藻糖代謝的基因調節與糖信號途徑的相互作用，能增強光合能力，蔗糖的添加促進大豆根中蔗糖的合成，而加入海藻糖和有效霉素A(海藻糖酶的高效抑制劑)，也刺激蔗糖的合成，而加入葡萄糖時，卻沒有這種促進作用[26]。豆科植物中海藻糖酶基因(PvTRE1)的表達受到RNA干擾(RNAi)而下降，除增加海藻糖質量分數外，還提高了參與碳代謝的相關基因的表達(PvSUS1、PvHXK1、PvSnRK1)[27]。本試驗可以看出無論干旱還是外源增加ABA均會促進果實中葡萄糖、果糖和山梨醇的積累。T6P作為海藻糖的前體，與蔗糖有雙向調節作用，植物保持著相對恒定的T6P：蔗糖的比值，這個比值是植物維持體內蔗糖水平的穩態機制的一部分[28]，在本次試驗中，外源添加脫落酸促進海藻糖的積累后，可能由于海藻糖質量分數的升高導致果實中葡萄糖、山梨醇、果糖質量分數的升高及蔗糖質量分數的降低，因此可以推測果實中海藻糖的積累可能與糖代謝有關。海藻糖在糖代謝途徑中的作用仍需進一步研究。通過果實基本品質的測定發現，干旱會在一定程度上減少果實單果質量，但輕度干旱(土壤含水量達土壤最大持水量的60%～65%)條件下，果實單果質量下降并不顯著，而中度干旱(土壤含水量達土壤最大持水量的50%～55%)則顯著降低果實單果質量，其他方面如果實硬度和果實色澤a*，雖然干旱后都顯著下降，但中度干旱條件下下降更為顯著，并且輕度干旱時果實可溶性固形物的質量分數最大，比中度干旱時質量分數大但并不顯著，所以成熟期輕度干旱提高果實品質。

綜上所述，在果實成熟期控制土壤相對含水量使果樹處于適度干旱條件下，促進果實中糖分的積累，結合干旱處理和外源注射ABA處理可以得出，干旱條件下促進內源脫落酸的積累，影響海藻糖代謝途徑相關酶活性的改變，促進海藻糖的積累，有利于果實中可溶性糖質量分數的增加，而海藻糖的積累可能與內源ABA的積累有較大關系。