黃芪多糖對犬血清免疫球蛋白、IFN-γ水平及分泌型IgA表達的影響

舒迎霜，賀濛初，曹護群，夏曉冬，馮士彬，李 玉，王希春，李錦春，吳金節

(安徽農業大學 動物科技學院，合肥 230061)

黃芪又名綿芪、綿黃芪，為豆科多年生草本植物，蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根臨床應用十分廣泛，該藥最早記載于《神農本草經》，味甘微溫，具有益氣固表、斂汗固脫、利水消腫之功效。此外，黃芪中包含多糖、甲苷、黃酮、生物堿等多種有效成分，在體內和體外均有顯著的免疫調節作用[1]。臨床實踐證明，黃芪甲苷和黃芪黃酮均可通過NF-κB信號通路不同程度地增強小鼠RAW264.7細胞的免疫功能[2-3]。黃芪多糖(Astragaluspolysaccharides,APS)為黃芪中最主要的活性成分，具有免疫調節、抗腫瘤、保護腸道等多方面作用。盧慧等[4]研究發現，APS能顯著增加雛雞體內B淋巴細胞的增殖、分化和漿細胞的分泌功能，增強機體的免疫反應。Chen等[5]研究發現，APS可使失衡的輔助性T淋巴細胞亞群Th1和Th2及其分泌的細胞因子回到正常水平，表明APS可作用于Th細胞來調節細胞因子如IL、IFN-γ等來實現免疫調節作用。APS可顯著提高雞外周血中IFN-γ、IL-4和IL-12的質量濃度，以調節Th1/Th2平衡，增強機體免疫[6]。腸道是動物機體內最大的免疫器官，腸黏膜淋巴組織含有大量分泌型IgA(Secretory IgA, SIgA)，在腸黏膜受到抗原刺激時就會激活黏膜免疫應答。研究發現[7]APS可能是通過TLR4途徑誘導機體脾臟內毒素耐受性免疫應答，增強機體腸黏膜免疫功能。單春蘭[8]研究報道，口服APS可以顯著增加雛雞腸黏膜IgA細胞數量以及SIgA的分泌，增強腸道的免疫應答。

目前，關于APS對豬、鼠、禽等動物免疫調節和有關疾病防治的報道較多，但APS對犬免疫機能影響的研究鮮見報道。本研究旨在探討APS對犬血清IFN-γ水平、免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)水平、各腸段IgA mRNA和SIgA表達水平的影響，以研究APS調節犬免疫功能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗動物 1歲齡健康比格犬18只，體質量10 kg左右，由南京亞東試驗動物研究中心提供。試驗前常規驅蟲與免疫，定時定量喂食，自由飲水。

1.1.2 中藥材和試劑 黃芪購自安徽合肥梅山路立方大藥房；犬γ-干擾素(IFN-γ)、IgA、IgG和IgM ELISA檢測試劑盒均購自上海源葉生物科技有限公司；免疫組化一抗試劑兔抗人分泌型IgA抗體購于北京博奧森生物技術有限公司；免疫組化二抗試劑羊抗兔IgG抗體購自北京中杉金橋生物科技有限公司；無水乙醇購自無錫展望化工試劑有限公司。

1.1.3 試驗主要儀器 TD-100小型提取濃縮機組(浙江森力機械科技有限公司)，MK3型半自動酶聯免疫分析儀(美國Thermo公司)，CX31正置光學顯微鏡(日本OLYMPUS 公司)，YD-1508 R輪轉式切片機(浙江金華益迪醫療設備廠)，HPX-9082MBE電熱恒溫培養箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)，DW-86L388A -80 ℃冰箱(青島海爾特種電器有限公司)，臺式低速離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司)，LGJ-12N冷凍干燥機(北京亞星儀科科技發展有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 中藥制備 參照文獻[9]，稱取5 kg黃芪，去除雜質，清洗3次，瀝干水分，黃芪與酒精按照質量比1∶10加至50 Lφ=80%的酒精，提取3次，每次1 h，去除油脂。取出藥渣用電恒溫培養箱60 ℃烘干，再稱質量，按照料液比1∶20加入純水，超聲波震蕩提取80 min。將藥液轉移至濃縮罐中濃縮至4 L，再加入3倍量的φ=95%的酒精，4 ℃靜置12 h，使黃芪多糖沉淀，3 000 r/min 離心5 min，取沉淀，加蒸餾水溶解至4 L。加入等體積φ=5%的三氯乙酸，同時加入適量活性炭(樣品量的15%～20%)脫色，濾去活性炭，4 ℃靜置24 h，使蛋白沉淀除去蛋白。3 000 r/min 離心5 min，棄去沉淀，取上清液加2 mol/L 的NaOH調節pH為7.0，濃縮至4 L。加入3倍量φ=95%的酒精，使醇達到80%，低溫靜置，得疏松沉淀物，洗滌干燥得脫蛋白黃芪多糖粉，4 ℃ 保存，備用。經苯酚硫酸法測得多糖提取率為12.91%。

1.2.2 試驗分組及犬的飼養管理 18只純種比格犬隨機分為3組，即對照組(只飼喂基礎日糧)、黃芪多糖低劑量組(基礎日糧+以生藥計w=1%的黃芪多糖)和黃芪多糖高劑量組(基礎日糧+以生藥計w=2%的黃芪多糖)，每組6 只，試驗期14 d，試驗期間3組試驗犬飼喂管理條件一致，每天定點飼喂2 次相應日糧，上下午各 1 次，每次150 g，自由飲水。

1.2.3 樣品采集 分別在試驗的第0、7和14天采集血液，采血前保證試驗犬空腹12 h，前肢靜脈采血(每次每只采血1.5～3 mL)，所采血液放于非抗凝管，待血液凝固后于3 000 r/min離心10 min，分離血清后分裝于1.5 mL離心管，-20 ℃保存，備用。試驗結束后，全部試驗犬麻醉放血后解剖，取十二指腸、空腸中段和回腸，輕微沖洗，每個腸段分成2份，分別放置在φ=4% 多聚甲醛和液氮中速凍，-80 ℃保存。

1.2.4 血清免疫因子的測定 采用ELISA法檢測血清中IFN-γ、IgA、IgM和IgG 水平，嚴格按照試劑盒說明操作，在460 nm處測得樣本OD值后，再在Excel中根據說明書中標準品濃度和測得的OD值建立標準曲線，獲得相應回歸方程，計算血清中樣本濃度。

1.2.5 RT-qPCR法檢測各腸段IgA mRNA相對表達量 從-80 ℃取出腸段組織樣本，分別用液氮研磨粉碎，加入1 mL Trizol提取總RNA，使用Invitrogen的反轉錄試劑盒Superscript Ⅲ將提取的總RNA進行反轉錄，獲得cDNA，-20 ℃保存，備用。根據GenBank中犬IgA及Actin的基因序列(GenBank登錄號分別為AY_576788.1和NM_001003195.1)，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物(表1)，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。采用SYBR QPCR mix試劑，ABI-7900 qPCR儀檢測犬各腸段中IgA mRNA的相對表達量，結果以2-ΔΔCt表示。

表1 qPCR擴增的引物序列Table 1 Primer sequence for qPCR amplification

1.2.6 免疫組化法檢測犬各腸段SIgA蛋白表達量 從多聚甲醛中取出腸道組織，制作石蠟切片，常規免疫組化法檢測各個腸段組織中的SIgA蛋白表達位點及表達量，同時設置陰性對照，陰性對照以PBS代替一抗，其他操作均一致，中性樹膠封片。采用Olympus顯微鏡Images圖像分析系統對免疫組化各腸道切片進行拍照，同一個組織選擇3個視野拍照保存，將圖片導入Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行分析，SIgA蛋白的陽性表達率用平均光密度值(Density mean)表示。

1.2.7 數據分析 采用SPSS 19.0統計軟件分析數據，結果以“平均值±標準差”表示，使用單因素方差分析(One-way ANOVA)和最小顯著差數(LSD)法進行多重比較；組間比較采用LDS法檢驗。

2 結果與分析

2.1 黃芪多糖對犬血清中Ig和IFN-γ水平的影響

2.1.1 IgA水平檢測 由表2可知，第0天時，各組IgA水平差異不顯著(P>0.05)；第7天時，高、低劑量組均顯著高于對照組(P<0.05)；第14天時，高劑量組極顯著高于對照組(P<0.01)，低劑量組顯著高于對照組(P<0.05)。

2.1.2 IgG水平檢測 由表3可知，第0天時，各組IgG水平差異不顯著(P>0.05)；第7天時，高劑量組顯著高于對照組(P<0.05)，低劑量組與對照組差異不顯著(P>0.05)；第14天時，高、低劑量組均顯著高于對照組(P<0.05)。

2.1.3 IgM水平檢測 由表4可知，第0天時，各組IgM水平差異不顯著(P>0.05)；第7天時，組有升高趨勢，但與對照組差異均不顯著(P>0.05)；第14天時，高劑量組顯著高于對照組(P<0.05)，低劑量組與對照組差異不顯著(P>0.05)。

表2 血清中IgA水平檢測Table 2 Detection of serum IgA levels(n=6) ng/mL

注：同列小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)，下同。

Note: the difference of lowercase letters in the same column indicate significant difference(P<0.05), and the differences of uppercase letters indicate that extremely significant difference(P<0.01), the same below.

表3 血清中IgG水平檢測Table 3 Detection of serum IgG levels(n=6) ng/mL

表4 血清中IgM水平檢測Table 4 Detection of serum IgM levels(n=6) ng/mL

2.1.4 INF-γ水平檢測 由表5可知，第0天時，各組IFN-γ水平差異不顯著(P>0.05)；第7天時，高劑量組顯著高于對照組(P<0.05)，低劑量組與對照組差異不顯著(P>0.05)；第14天時，高劑量組極顯著高于對照組(P<0.01)，低劑量組顯著高于對照組(P<0.05)。

2.2 黃芪多糖對犬各腸段IgA mRNA相對表達量的影響

如表6所示，喂食黃芪多糖2周后，高、低劑量組犬各腸段IgA mRNA相對表達量較對照組均有升高趨勢。其中十二指腸和回腸中高劑量組顯著高于對照組(P<0.05)，低劑量組高于對照組，但差異不顯著(P>0.05)；回腸中高、低劑量組均顯著高于對照組(P<0.05)。

2.3 黃芪多糖對犬各腸段SIgA表達的影響

由圖1可以看出，SIgA蛋白在犬十二指腸、空腸及回腸均有表達，蛋白陽性表達區域呈棕黃色，蛋白表達越多棕黃色也就越深，該蛋白主要分布在固有層及腸腺周圍。黏膜固有層內含有大量淋巴細胞，如T細胞、B細胞及肥大細胞等多種免疫細胞，主要以T 、B淋巴細胞為首，且二者數量相當，當機體受到抗原刺激時，大量的SIgA即被分泌以介導機體的免疫調節作用[10]。

表5 血清中IFN-γ水平檢測Table 5 Detection of serum IFN-γ levels(n=6) ng/mL

表6 犬各腸段IgA mRNA的相對表達量Table 6 Relative expression of IgA mRNA in small intestine of canines

A.陰性對照 Negative control;B.對照組 Control group;C.黃芪多糖低劑量組 APS low dosage group;D.黃芪多糖高劑量組 APS high dosage group;1.十二指腸 Duodenum;2.空腸 Jejunum;3.回腸 Ileum

圖1各腸段SIgA表達檢測(免疫組化,×400)
Fig.1DetectionofSIgAexpressionindifferentintestinalsegments(IHC,×400)

由表 7 可知，APS組犬的各個腸段SIgA蛋白表達均有不同程度增加。其中十二指腸中低劑量組顯著高于對照組(P<0.05)，高劑量組極顯著高于對照組(P<0.01)；空腸高劑量組極顯著高于對照組(P<0.01)，低劑量組與對照組差異不顯著(P>0.05)；回腸中組顯著高于對照組(P<0.05)，APS組組間差異不顯著(P>0.05)。

表7 各腸段SIgA表達水平Table 7 Expression levels of SIgA in different intestinal segments

3 討 論

研究證實黃芪多糖可作為廣泛的免疫增強劑，通過影響機體細胞物質代謝、激活相關細胞因子、增強機體的特異性和非特異性免疫應答來增強免疫功能，但是有關黃芪多糖對犬血清及腸黏膜免疫功能的相關研究未見報道。

IFN-γ 是機體內調節免疫功能的重要細胞因子，IFN-γ最重要的作用是激活巨噬細胞和NK細胞從而促進Th0細胞向Th1細胞分化[11]。國欣欣等[12]研究證明，APS可在體外誘導大鼠腸黏膜微血管內皮細胞(Rat intestinal mucous microvascular endothelial cells, RIMVECs)合成并分泌內源性IFN-γ，可在細胞水平上加固屏障發揮免疫調節作用，增強機體免疫力。現代藥理研究實踐也證明，黃芪多糖具有抗病毒、抗氧化及調節機體免疫的功能，并能誘導機體免疫細胞產生和分泌干擾素[13]，因此IFN-γ主要是通過細胞介導促進機體的免疫功能。楊紅洋等[14]研究中藥復方多糖對不同基因型雞血清細胞因子的影響，發現不同劑量的中藥復方多糖均能提高雞血清中IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ水平，增強機體抵抗病原的能力。APS同樣可提高血清細胞因子(TNF-α、IL-2和IFN-γ)水平及免疫細胞(巨噬細胞、淋巴細胞和NK細胞)的活性，輔助抗體和吞噬細胞抵抗病原微生物的入侵，介導免疫溶菌作用，從而增強機體免疫力[15]。血清中的免疫球蛋白主要有3種，即IgA、IgG和IgM，這3種免疫球蛋白參與的主要是體液免疫，可維持機體內環境的穩態平衡，因此檢測Ig也是觀察體液免疫功能強弱的重要指標之一。Assinewe等[16]報道，APS能促進機體產生特異性IgG、IgA和IgM，并且增加T細胞百分數。Wang等[17]研究發現，用APS喂養海參 2 個月，可以改善海參的吞噬細胞能力、溶菌酶活力等，從而增強其非特異性免疫應答。本研究結果表明，黃芪多糖可顯著或極顯著提高犬血清中IFN-γ、免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)水平，從而增強犬免疫力。

腸道黏膜免疫是機體抵御外界病原微生物入侵的第一道防線，當外界的抗原入侵腸腔時，巨噬細胞就會通過腸黏膜中的抗原呈遞細胞將抗原物質集結起來并加工，再將加工后的抗原呈遞給輔助性T細胞，輔助性T細胞激活B淋巴細胞使其增殖分化產生大量SIgA進入腸腔內，以此增強腸道免疫力[10]。其中B淋巴細胞和T淋巴細胞主要存在于腸黏膜固有層，且固有層分布著機體約80% IgA+細胞，在腸黏膜上皮表面還有肥大細胞也參與機體的免疫調節，當動物口服黃芪多糖時，大量黃芪多糖被小腸壁吸收，肥大細胞數量增多，其分泌的細胞因子含量上升，使巨噬細胞呈遞抗原的作用加強， SIgA的含量也隨之增加[18]。因此，評價腸黏膜免疫力強弱的標志之一即為檢測腸道中SIgA的含量。李任軍等[19]研究發現，給小鼠口服黃芪多糖能顯著增加IELs和固有層IgA+細胞數量，增強腸道免疫功能。Rey等[20]研究發現，SIgA能夠被派氏結中的樹狀突細胞吞噬進入腸黏膜，從而起到保護腸道增強腸道免疫的作用。Li等[21]研究指出，黃連素能夠顯著提高小鼠腸黏膜中SIgA的水平。陳家順等[22]研究血根堿作為飼料添加劑對斷奶仔豬腸道免疫功能的影響，發現飼糧中添加血根堿可顯著提高斷奶仔豬小腸黏膜IgA、IgG 和IgM的含量，達到與抗生素相當的效果。本研究結果表明，黃芪多糖組犬腸黏膜IgA mRNA及SIgA蛋白表達水平均顯著高于對照組，表明黃芪多糖可促進犬腸道合成并分泌SIgA，從而增強犬的腸黏膜免疫功能。

4 結 論

黃芪多糖不僅可以提高犬血清中IFN-γ、IgA、IgG 和IgM的水平，增強機體的細胞及體液免疫功能，其中2%黃芪多糖組的免疫增強效果優于1%黃芪多糖組。黃芪多糖還能促進犬小腸黏膜IgA mRNA的表達以及SIgA的合成與分泌，表明黃芪多糖能增強犬的腸黏膜免疫，提高犬的免疫機能。