Foxa2在結直腸息肉和結直腸癌中的表達及其意義

彭 好 沈 磊

武漢大學人民醫院消化內科(430060)

背景：叉頭框蛋白A2(Foxa2)在結直腸癌的增殖和遠處轉移中具有重要作用，但關于Foxa2在結直腸息肉中的表達未見相關報道。目的：探討Foxa2在結直腸息肉和結直腸癌中的表達及其意義。方法：選取2018年1月—2019年5月至武漢大學人民醫院收治的45例增生性息肉、135例腺瘤性息肉和45例結直腸癌及其相應癌旁正常黏膜組織。采用免疫組化SP法檢測Foxa2表達情況，實時熒光定量PCR和蛋白質印跡法分別檢測Foxa2 mRNA和蛋白表達，并分析Foxa2表達與結直腸息肉、結直腸癌之間的關系。結果：Foxa2在正常結直腸黏膜組織、增生性息肉、腺瘤性息肉、結直腸癌中的陽性表達率分別為13.3%、31.1%、62.2%、86.7%，組間相比差異有統計學意義(P<0.05)。正常結直腸黏膜組織、增生性息肉、腺瘤性息肉、結直腸癌中Foxa2 mRNA和蛋白表達逐漸增高，組間相比差異有統計學意義(P<0.05)。Foxa2表達與腺瘤性息肉的大小、是否帶蒂有關(P<0.05)；與結直腸癌分化程度、淋巴結轉移、TNM分期有關(P<0.05)。結論：Foxa2在腺瘤性息肉和結直腸癌中高表達，且隨著息肉癌變風險提高而增高，因此檢測結直腸息肉組織中Foxa2蛋白表達有助于早期發現結直腸癌。

結直腸癌是常見的惡性腫瘤之一[1]。隨著飲食結構的改變，我國結直腸癌的發病率呈逐漸上升的趨勢[2]。結直腸息肉是結直腸黏膜的隆起性病變，常見病理類型包括炎性息肉、增生性息肉、腺瘤性息肉等，其中腺瘤性息肉屬于結直腸癌的癌前病變[3]。目前關于腺瘤性息肉癌變的機制尚不清楚。從分子生物學角度研究腺瘤性息肉與結直腸癌之間的關系，對于預防、診斷、治療結直腸癌具有重要意義。叉頭框蛋白A2(forkhead box A2, Foxa2)又稱為肝細胞核因子3β(hepatocyte nuclear factor 3β, HNF3β)，其能與DNA啟動子區結合來調節基因的表達，在細胞分化、細胞代謝中發揮重要作用[4-5]。有研究[6]表明，Foxa2能促進結腸癌細胞增殖、遷移、侵襲。本研究通過檢測不同類型結直腸息肉以及結直腸癌中Foxa2的表達，旨在探討Foxa2、結直腸息肉、結直腸癌三者之間的關系，從而為預防、診斷、治療結直腸癌提供一種新手段。

材料與方法

一、臨床資料

收集2018年1月—2019年5月至武漢大學人民醫院消化內鏡中心行內鏡下切除的增生性息肉45例、腺瘤性息肉135例，其中管狀腺瘤、管狀絨毛狀腺瘤、絨毛狀腺瘤各45例，另取外科手術切除的結直腸癌及其配對的正常結直腸黏膜(距腫瘤邊緣>5 cm)組織各45例。在180例息肉患者中，男107例，女73例，年齡26～81歲，平均(55.60±14.16)歲；45例結直腸癌患者中，男22例，女23例，年齡40～79歲，平均(62.78±9.20)歲。根據2000年WHO消化系腫瘤分類標準，高中分化腺癌17例，低分化腺癌28例；無淋巴結轉移15例，有淋巴結轉移30例；TNM分期采用國際抗癌聯盟2009年發布的第7版分期標準，Ⅰ+Ⅱ期19例，Ⅲ+Ⅳ期26例。收集的各組樣本組織立即置于液氮中，-80 ℃保存。

二、方法

1.免疫組化SP法：將4 μm厚的石蠟切片進行二甲苯脫蠟、乙醇水合、蒸餾水浸洗后，置于0.01 mol/L MEDTA緩沖液(pH 9.0)中，微波爐熱修復25 min，TBS沖洗。0.3%雙氧水去除內源性過氧化物酶，滴加小鼠抗人Foxa2抗體(稀釋濃度1∶100，美國R&D公司)，PBS代替一抗作為陰性對照，于4 ℃濕盒子中孵育15 h，加酶標二抗，0.25% Triton X-100室溫破膜10 min，TBS沖洗。DAB顯色(購自Agilent Technologies, Inc.)，蘇木素復染，脫水、封片，顯微鏡下觀察和采集圖像。

結果判定：Foxa2免疫組化陽性產物呈棕黃色或棕褐色，主要位于細胞核內，部分組織中因轉錄因子表達的不同時相，可在胞質或胞膜上特異性表達。高倍鏡(×400)下隨機選取4個視野，評估染色的陽性程度和陽性面積。陽性強度：無色，0分；黃色，1分；棕黃色，2分；棕褐色，3分。陽性面積：<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。染色總分為強度與陽性面積之積，總分0分為不表達，1～3分為弱表達，4～6分為中度表達，7～9分為強表達，將0～3分定義為陰性，4～9分定義為陽性。

2.實時熒光定量PCR法檢測Foxa2 mRNA含量：提取各組組織RNA，反轉錄合成cDNA。行實時熒光定量PCR法，反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40個循環。Foxa2引物由天一輝遠生物科技有限公司合成，引物序列上游：5’-GCG ACC CCA AGA CCT ACA G-3’，下游：5’-GGT TCT GCC GGT AGA AGG G-3’；以GAPDH作為內參，上游：5’-CAT GAG AAG TAT GAC AAC AGC CT-3’，下游：5’-AGT CCT TCC ACG ATA CCA AAG T-3’。采用2-△△Ct法計算Foxa2 mRNA相對表達量。實驗重復3次，取均值。

3.蛋白質印跡法檢測Foxa2蛋白表達：各組組織勻漿離心后制成細胞裂解液，行SDS-PAGE電泳，然后轉移至PVDF膜。加入一抗GAPDH(杭州賢至生物科技有限公司)、Foxa2(R&D Systems)，稀釋比例為1∶1 000，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜5～6次。加入HRP的標記二抗(武漢博士德生物工程有限公司)(1∶50 000稀釋)，37 ℃搖床孵育2 h，TBST充分洗滌。顯色，攝片。采用Image J圖像分析軟件測定條帶灰度值，以Foxa2條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值作為Foxa2蛋白的相對表達。

三、統計學分析

結 果

一、Foxa2蛋白在不同病理組織中的表達

不同組別中Foxa2表達見圖1。與正常結直腸黏膜組相比，增生性息肉組、腺瘤性息肉組、結直腸癌組Foxa2表達率均顯著升高(31.1%、62.2%、86.7%對13.3%，P<0.05)；與增生性息肉組相比，腺瘤性息肉組、結直腸癌組Foxa2表達率均顯著升高(P<0.05)；結直腸癌組又顯著高于腺瘤性息肉組(P=0.002)。此外，腺瘤性息肉組中Foxa2表達率隨著絨毛含量的增加而有所升高，但組間差異無統計學意義(P>0.05；表1)。

在135例腺瘤性息肉中，低級別上皮內瘤變為57例，陽性表達率為61.4%(35/57)；高級別上皮內瘤變為8例，陽性表達率為75%(6/8), 兩者之間差異無統計學意義(P=0.723)。

二、Foxa2 mRNA表達

Foxa2 mRNA在正常組織、增生性息肉、腺瘤性息肉、結直腸癌中的表達逐漸增加，且兩兩之間差異有統計學意義(P<0.05;圖2、表2)。

A：正常結直腸黏膜；B：增生性息肉；C：管狀腺瘤；D：管狀絨毛狀腺瘤；E：絨毛狀腺瘤；F：結直腸癌

圖1 Foxa2蛋白在不同病理組織中的表達(免疫組化SP法，×400)

表1 不同病理組織中Foxa2表達情況

*與正常結直腸黏膜組比較，P<0.05；#與增生性息肉組比較，P<0.05；▲與腺瘤性息肉組比較，P<0.05

1：正常結直腸黏膜組；2：增生性息肉組；3：腺瘤性息肉組；4：結直腸癌組

a與正常結直腸黏膜組比較，P<0.05；b與增生性息肉組比較，P<0.05；c與腺瘤性息肉組比較，P<0.05

圖2 不同病理組織中Foxa2 mRNA表達(實時熒光定量PCR法)

表2 各組組織中Foxa2 mRNA和蛋白表達情況

*與正常結直腸黏膜組比較，P<0.05；#與增生性息肉組比較，P<0.05；▲與腺瘤性息肉組比較，P<0.05

三、Foxa2蛋白表達

Foxa2蛋白含量在正常組織、增生性息肉、腺瘤性息肉、結直腸癌中的表達逐漸增加，且兩兩之間差異有統計學意義(P<0.05;圖3、表2)。

1：正常結直腸黏膜組；2：增生性息肉組；3：腺瘤性息肉組；4：結直腸癌組

a與正常結直腸黏膜組比較，P<0.05；b與增生性息肉組比較，P<0.05；c與腺瘤性息肉組比較，P<0.05

圖3 不同病理組織中Foxa2蛋白表達(蛋白質印跡法)

四、Foxa2表達與臨床病理參數之間的關系

Foxa2表達與腺瘤性息肉大小、是否有蒂有關(P<0.05)，而與患者的性別、年齡、息肉部位均無明顯相關性(P>0.05；表3)。Foxa2表達與結直腸癌的分化程度、淋巴結轉移、TNM分期有關(P<0.05；表4)。

表3 Foxa2表達與結直腸腺瘤性息肉患者臨床病理參數的關系(n)

*近端結直腸：距肛緣≤7 cm；遠端結直腸：距肛緣>7 cm

表4 Foxa2表達與結直腸癌患者臨床病理參數的關系(n)

討 論

結直腸癌發生的原因復雜多樣，涉及多基因、多因素的相互作用。結直腸腺瘤為目前公認的結直腸癌癌前病變，因此，對結直腸息肉性質的準確判斷以及防治是預防結直腸癌發生的重要手段。目前，早期診斷結直腸癌的常用分子生物學標志物包括SEPT9、vimentin、癌胚抗原(CEA)、細胞角蛋白20(CK20)、表皮生長因子受體(EGFR)等[7]。近年有研究發現Foxa2在結直腸癌細胞的增殖、遷移、侵襲等過程中具有一定作用[6]。本實驗通過對正常結直腸黏膜、增生性息肉、腺瘤性息肉、結直腸癌等組織中Foxa2的表達進行研究，并探討Foxa2、腺瘤性息肉、結直腸癌三者之間的關系，旨在為Foxa2預測結直腸息肉的癌變風險提供理論依據。

有研究表明，結直腸癌的發生、發展與Wnt-β-catenin、Hedgehog等信號通路關系密切[8-10]。Foxa2蛋白是一種調節基因轉錄和修復基因的DNA結合蛋白，通過結合順序調控序列來調節相關目標基因的表達，參與細胞增殖和分化過程，其表達異常與多種腫瘤的發生、發展密切相關，如膀胱癌[11]、乳腺癌[12]、肺癌[13]、肝癌[14]、胰腺癌、甲狀腺癌等。有研究[15]證實，在食管腺癌形成過程中，Hedgehog信號通路被激活，從而誘導其下游目的基因Foxa2的表達，導致食管腺癌組織中Foxa2蛋白表達增加。Villacorte等[16]的研究發現，在子宮內膜腺癌形成過程中，Wnt/β-catenin信號通路通過調節Foxa2基因及其上游區域，控制細胞周期從而調節細胞增殖。另一項研究[17]發現，Foxa2基因與其鄰近基因lncRNA-NEF相互促進表達，抑制Wnt/β-catenin信號通路，從而抑制肝癌細胞的上皮-間質轉化和遠處轉移。上述研究結果提示Foxa2可通過Wnt/β-catenin、Hedgehog等信號通路在腫瘤的形成和發展中起有重要作用。

本研究結果發現，Foxa2在增生性息肉中的表達率明顯高于正常結直腸黏膜(P<0.05)。這可能是增生性息肉產生過程中，Hedgehog信號通路有所上調，激活下游目標基因Foxa2的表達。腺瘤性息肉和結直腸癌中Foxa2表達率明顯高于增生性息肉，這可能是在腺瘤性息肉發生和發展過程中，Wnt/β-catenin信號通路和Hedgehog信號通路共同激活Foxa2表達所致[18]。進一步研究發現，分化程度越低、TNM分期越晚、有淋巴結轉移的結直腸癌組織中，Foxa2表達陽性率越高。Wang等[6]的研究發現，siR-Foxa2干擾組HCT116和HT29細胞出現G1/S期阻滯，細胞遠處轉移和侵襲減少，提示下調Foxa2可抑制結直腸癌細胞增殖、遠處轉移。本研究中，腺瘤性息肉組織中Foxa2表達隨息肉絨毛含量的增加而增加，但差異并無統計學意義(P>0.05)；高級別上皮內瘤變中的表達高于低級別上皮內瘤變，差異亦無統計學意義(P>0.05)；Foxa2表達在高級別上皮內瘤變組與結直腸癌組之間差異無統計學意義(P=0.754)，但低級別上皮內瘤變組與結直腸癌組之間差異有統計學意義(P=0.005)；Foxa2表達與腺瘤性息肉大小、是否有蒂有關(P<0.05)，而與患者的性別、年齡、息肉部位均無關(P>0.05)。說明Foxa2蛋白表達隨著結直腸息肉惡變風險的增加而明顯增強，息肉大小、是否有蒂可影響Foxa2蛋白的表達。

綜上所述，Foxa2在結直腸腺瘤性息肉和結直腸癌中高表達，且隨著息肉癌變風險提高而增加。因此，通過檢測Foxa2表達有望預測結直腸息肉癌變風險。但Foxa2參與結直腸息肉癌變和結直腸癌發生、發展的機制尚不明確，有待進一步深入研究。