基因工程小鼠胃癌模型的研究進展*

黃可婷 金多晨 黨旖旎 張國新

南京醫科大學第一附屬醫院消化科(210029)

胃癌是全球第二大腫瘤相關死亡原因，5年生存率小于25%[1]。動物模型能模擬體內胃癌發生、轉化、侵襲等一系列生物學特性，是研究胃癌及其潛在機制的重要工具。近年來，隨著基因工程和分子生物學技術的發展，基因工程小鼠模型的運用越來越廣泛。這種小鼠模型往往用于探究特定基因型與疾病表型的關聯，極大地豐富了對宿主基因功能和疾病遺傳特征的理解。本文就常見的基因工程小鼠胃癌模型作一綜述。

一、胰島素-胃泌素(insulin-gastrin, INS-GAS)小鼠

INS-GAS小鼠是應用最為廣泛的腸型胃癌模型，其轉基因序列由人胃泌素編碼序列上游的胰島素啟動子組成。小鼠早期表現為高胃泌素血癥、胃萎縮，隨后向腸化生和異型增生發展，20月齡時75%發生胃體侵襲性腫瘤[2]。幽門螺桿菌(Hp)是INS-GAS小鼠的Ⅰ類致癌物，Hp感染后小鼠腸化生明顯加快，且易發生黏膜內浸潤和血管浸潤[2]。由于致癌閾值低，重現性好，Hp感染的INS-GAS小鼠是較為理想的胃體腫瘤模型。

目前，這種小鼠模型主要用于研究胃癌的發病機制、干預治療、菌群共生等。Hp感染促進小鼠體內胃泌素表達，進而誘導胃上皮細胞尤其是壁細胞凋亡[3]。同時，Hp感染可抑制小鼠核苷酸結合寡聚化結構域1(nucleotide-binding oligomerization domain containing 1, Nod1)受體表達，改變巨噬細胞的極化狀態，加重損傷反應[4]。作為藥物治療模型，INS-GAS小鼠已獲得良好的應用。有研究[5]將雌二醇聯合他莫昔芬治療小鼠胃癌，證實了雌激素信號轉導在胃癌中的作用。經化療藥物吉非替尼干預后，INS-GAS小鼠體內表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)受到抑制，提示吉非替尼對胃癌有潛在的治療效應[6]。此外，對不同感染狀態下INS-GAS小鼠的研究[3]發現，腸道細菌協同Hp感染可誘導胃癌的發生。三種腸道細菌(包括ASF356梭菌屬、ASF361乳桿菌屬和ASF519擬桿菌屬混合物)促進INS-GAS小鼠胃部病變，Hp感染可加速病變進展[7]。最近一項評估Hp感染后小鼠胃黏膜譜系變化的研究[8]結果表明，Hp主要啟動胃中解痙多肽表達型化生(spasmolytic polypeptide-expressing metaplasia, SPEM)，進一步腸道細菌感染可促進凹陷性增生、腸化生和血管侵襲。上述研究結果提示，Hp誘導INS-GAS小鼠發生胃癌需要額外細菌的作用，腸道細菌定植可能是胃癌發生的另一重要原因。

二、TFF1基因敲除(TFF1-/-)小鼠

TFF1(又稱pS2)屬三葉肽家族成員，具有黏膜保護和修復的作用。TFF1-/-小鼠最早由Lefebvre等[9]通過同源重組技術進行構建，所有小鼠均發展為胃竇和幽門腺瘤，30%發展為多灶性上皮內癌或黏膜內癌。Hp與TFF1沉默表達具有協同作用，Hp感染后TFF1-/-小鼠胃腺癌的發生率顯著增加[10]。體外實驗表明，TFF1能與Hp相互作用特異性結合人胃黏蛋白，促進細菌在胃黏液層中的定植[11]。該現象解釋了細菌對胃組織的趨向性，但尚缺乏體內證據，需進一步研究來闡明兩者之間的關系。

TFF1-/-小鼠模型常用于免疫細胞浸潤、信號轉導失調和上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)等促癌機制的研究。與野生型小鼠相比，TFF1-/-小鼠胃竇組織中存在大量T細胞和巨噬細胞，TFF1沉默是胃內免疫細胞浸潤的關鍵步驟[12]。研究表明，多種信號通路通過介導TFF1參與胃癌的發生。TFF1基因沉默可激活腫瘤壞死因子α/IκB激酶(TNF-α/IKK)途徑，促進NF-κB介導的炎癥反應[13]。通過調節AKT-GSK-3β軸，TFF1沉默促進β-連環蛋白活化，進而誘導腫瘤的形成[14]。在炎-癌轉化過程中，EMT與TFF1表達相關。胃損傷誘導TFF1表達上調，最終觸發EMT參與黏膜損傷的修復[15]。TFF1在炎癥中表達增高而在腫瘤中表達沉默。最近一項檢測胃黏膜變化的研究[16]發現，Hp急性感染期(<2周)TFF1表達上調以抑制炎癥；當感染持續存在時，TFF1表達下降直至沉默。發生其他消化系統腫瘤(如胰腺腫瘤)時，TFF1-/-小鼠亦可檢測出EMT表型[17]。然而，胃癌中TFF1與EMT之間的關聯尚未見報道。

三、Gp130敲入突變(gp130757F/F)小鼠

Gp130757F/F小鼠由敲入點突變產生，該突變將細胞內gp130 757位置上酪氨酸殘基(Y)轉化為苯丙氨酸殘基(F)，可阻斷SHP-2/Ras/ERK信號轉導[18]。Gp130757F/F小鼠體內TFF1表達缺失，病理表現與TFF1-/-小鼠類似，3個月時進展為胃腺瘤，成瘤率100%[19]。Gp130受體主要觸發下游三種信號途徑，即JAK/STAT、SHP-2/ERK/MAPK和Src/PI3K/AKT。Hp通過細胞毒素相關蛋白(cytotoxin-associated gene A protein, CagA)影響不同通路的活性，磷酸化的CagA激活SHP2/ERK，而未磷酸化的CagA激活JAK/STAT3途徑[20]。

Gp130757F/F小鼠模型主要用于研究gp130配體在炎癥反應、免疫應答和淋巴結轉移中的信號轉導作用。細胞因子白細胞介素11(interleukin-11, IL-11)和IL-6是gp130的主要配體。IL-11通過經典途徑激活STAT1/3，是gp130信號轉導的關鍵因子[21]。作為潛在的治療靶點，IL-11通過gp130/JAK/STAT3/Bcl-2途徑參與胃癌化療藥物的耐藥作用，靶向IL-11治療可能是克服耐藥的新策略[22]。IL-6在胃竇中的活性較低，與腫瘤侵襲相關，而與腫瘤生長無關[23]。除炎癥反應外，宿主免疫應答在腫瘤進展過程中亦發揮重要作用。免疫相關基因Toll樣受體2(Toll-like receptor 2, TLR2)和髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)可被STAT3激活，以不依賴炎癥的方式調節胃腫瘤細胞增殖和凋亡[24-25]。最新研究[26]還發現，gp130757F/F小鼠胃竇黏膜下層富含淋巴樣的聚集體，其中gp130/STAT3信號軸可驅動體內胃腫瘤的三級淋巴結構發展，促進胃癌的發生和轉移。Gp130757F/F小鼠遵循經典的腸型胃癌發展序列，與人類腫瘤相似度極高，研究胃癌免疫細胞的免疫效應以及轉移和侵襲性表型可選擇該模型。

四、H/K-ATPase-IL-1β小鼠

IL-1β是一種多效的促炎因子，具有強烈的抑酸作用。通過抑制細胞內鈣離子的釋放，IL-1β可抑制Sonic Hedgehog(Shh)基因表達[27]。Shh是Hedgehog蛋白家族成員，能調節胃上皮細胞分化，誘導胃內氫-鉀-ATP酶(H/K-ATPase)表達。利用鼠H/K-ATPase啟動子構建特異性表達人IL-1β的小鼠模型，即H/K-ATPase-IL-1β小鼠[28]。該小鼠表現為自發性胃炎、胃萎縮、腸化生，直至進展為胃癌。Hp與IL-1β協同參與胃腫瘤的發生、發展。與IL-1β作用類似，Hp感染抑制壁細胞Shh表達和H/K-ATPase轉錄[27]。敲除小鼠IL-1β基因，Hp感染引起的巨噬細胞和中性粒細胞募集減少，NF-κB活化減少[28]。由此推測，IL-1β可能是Hp感染的最終致病途徑。

H/K-ATPase-IL-1β小鼠模型目前被廣泛用于研究腫瘤早期的啟動機制、癌相關成纖維細胞(carcinoma-associated fibroblasts, CAFs)以及基質細胞在腫瘤微環境中的作用。通過激活NF-κB途徑，IL-1β募集胃內骨髓來源抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)[28]，對早期腫瘤的發生具有重要作用。至少20%的CAFs來源于骨髓間充質干細胞。IL-1β可誘導CAFs中的信號傳導，促進腫瘤向胞外基質和淋巴管侵襲[29]。在此過程中，基質細胞衍生因子-1募集MDSCs，促進胃異型增生[30]。此外，H/K-ATPase-IL-1β小鼠是檢測胃癌表觀遺傳學變化的重要工具。IL-1β可直接誘導胃腫瘤細胞的DNA甲基化[31]，表明炎癥因子可直接觸發表觀遺傳學變化來促進胃病發展，揭示了炎癥與胃癌之間的新機制。

五、其他

原癌基因K-ras的激活涉及多種惡性腫瘤的發生。將特異表達于胃頸/峽部的角蛋白19(keratin 19, K19)與K-ras融合，構建K19-K-ras-V12突變模型。結果顯示小鼠3個月時出現泌酸腺萎縮和黏液性化生，20月齡發生高度異型增生和黏膜下浸潤[32]。另一種K-ras突變模型由CK19CreERT基因插入LSL-K-rasG12D小鼠構成，這種小鼠早期出現SPEM、腸化生和胃祖細胞激活現象，與人癌前病變相似[33-34]。因此，具有K-ras突變的小鼠模型常用于研究早期胃癌的分子事件。

K19-Wnt1小鼠胃黏膜能特異表達Wnt1蛋白、環氧合酶2(cyclooxygenase 2, COX-2)和前列腺素E2[35]。K19-Wnt1小鼠與K19-C2mE小鼠雜交生成K19-Wnt1/C2mE小鼠，5周齡時可發生黏液性化生，20周齡時形成胃腫瘤[35]。這種小鼠模型主要用于探索Wnt途徑、COX-2和血管抑制素2等在胃癌生成中的機制[36]。

Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor 4, KLF4)是鋅指轉錄因子，主要表達于上皮細胞。KLF4敲除(KLF4-/-)小鼠由Villin-Cre+小鼠和Klf4fl/fl小鼠雜交培育而成，病理表現為胃上皮細胞增殖增加和分化改變，35周齡時形成胃竇前腫瘤，80周齡時29%小鼠發生胃竇腫瘤[37]。這種模型可用于胃竇干細胞誘導的自發性腫瘤研究。

六、結語

理想的動物模型是研究胃癌發病機制和改進治療策略的重要前提。基因工程小鼠直接將調控胃癌的特定基因轉染至胚胎組織中形成原發性腫瘤，其腫瘤進展過程和形態特征與人類腫瘤相似(表1)。這些小鼠對研究基因突變、信號通路、藥物研發以及藥效評估具有獨特的優勢，是極為理想的實驗模型。近年來，基因編輯技術CRISPR/Cas9被用于構建各種基因修飾的動物模型。有研究利用CRISPR/Cas9技術構建TFF-/-小鼠，這種新培育的模型的病理表型與以往研究一致[38]。另一項研究[39]則在gp130757F/F小鼠中敲除凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)，從而探討胃癌發生的新機制。CRISPR/Cas9基因編輯技術結合傳統的基因工程小鼠模型，可從分子水平進行單基因或多基因的敲除，避免既往單基因突變模型帶來的缺陷，更貼近人類腫瘤發生的特點，有望成為未來腫瘤研究的主流工具。本文從小鼠模型的造模方式、病理表型、與Hp感染的相關性、適用領域等角度進行總結，對胃癌的基礎研究具有重要的參考價值。

表1 基因工程小鼠胃癌模型匯總