利福昔明經TRPV1-VGLUT2/3通路影響大鼠內臟敏感性的研究*

楊長青 郭曉姝 李 季 趙 莉 趙甘婷 盛淑婷 魏子白

長治醫學院附屬和平醫院消化科(046000)

背景：利福昔明可明顯緩解腸易激綜合征患者的腹痛，但機制不明。目的：探討利福昔明對大鼠內臟敏感性的影響及其作用機制。方法：建立慢性避水應激大鼠模型，并將大鼠分為對照組、模型組和利福昔明組。行肌電圖評估大鼠內臟敏感性，免疫熒光法檢測L6S1 DRG中TRPV1、VGLUT2/3免疫活性，蛋白質印跡法檢測L6S1段脊髓中TRPV1、VGLUT2/3蛋白表達，行16S rDNA菌群測序分析。結果：慢性避水應激能誘導大鼠內臟敏感性增高，L6S1 DRG中TRPV1、VGLUT2/3免疫活性明顯增高，L6S1段脊髓中TRPV1、VGLUT2/3蛋白表達明顯增高，腸道菌群發生紊亂。給予利福昔明后，內臟敏感性明顯降低，L6S1 DRG中TRPV1、VGLUT2/3免疫活性明顯降低，L6S1段脊髓中TRPV1、VGLUT2/3蛋白表達明顯降低，腸道菌群紊亂明顯改善。TRPV1拮抗劑可明顯降低VGLUT2/3免疫活性。結論：利福昔明通過腸道菌群和TRPV1-VGLUT2/3通路改善應激誘導的大鼠內臟高敏感。

腸易激綜合征(IBS)是消化科門診的常見病，全世界發病率為10%～20%[1]。患者表現以腹痛為主并伴排便習慣改變，但腹痛癥狀目前尚無有效的治療方法，研究顯示內臟高敏感可能是引起腹痛的主要原因之一[2]。

利福昔明是一種腸道非吸收性抗菌藥物，能改變大鼠回腸的細菌種類，導致乳酸桿菌增加，從而預防慢性心理應激誘導的內臟高敏感[3]。利福昔明已被FDA批準用于IBS患者的治療，可有效改善腹痛癥狀[4]，但其具體作用機制尚未完全闡明。

有研究[5]結果顯示瞬時受體電位香草酸亞型1(transient receptor potential vanilloid 1, TRPV1)參與內臟高敏感的形成。囊泡谷氨酸轉運體-3(vesicular glutamate transporter 3, VGLUT3)參與結直腸擴張(CRD)誘導的內臟痛覺轉導過程，旋毛蟲一過性腸道感染可引起外周和中樞神經VGLUT3表達增加，參與內臟高敏感的形成[6]。目前尚未見利福昔明是否通過腸道菌群和TRPV1-VGLUT3通路誘導內臟高敏感的報道。本研究通過制備慢性避水應激(water avoidance stress, WAS)動物模型，并檢測背根神經節(DRG)和脊髓TRPV1、VGLUT2/3表達以及評估腸道菌群情況，旨在探討利福昔明改善IBS腹痛的可能機制，從而為利福昔明改善IBS患者腹痛癥狀提供新的理論基礎。

材料與方法

一、實驗動物

成年雄性Sprague-Dawley大鼠30只，體質量200～250 g，在標準條件下飼養。所有實驗程序均經長治醫學院動物倫理委員會批準。

二、方法

1.動物分組和模型制備：大鼠隨機分為WAS組、對照組和利福昔明組，每組各6只。將大鼠置于盛有水(25 ℃)的有機玻璃槽中央的玻璃板上，水平面低于玻璃板1 cm。限制大鼠活動，每天1 h，連續10 d，以制備慢性WAS模型。對照組玻璃槽中無水。利福昔明組大鼠先灌胃利福昔明(150 mg/kg，Sigma)，2次/d，連續10 d，然后行慢性WAS實驗。

2.內臟運動反應檢測和肌電圖分析：檢測前禁食24 h，乙醚輕度麻醉動物，將直徑為2 mm的一次性導尿管氣囊由肛門插入遠端結腸，球囊近端距肛門2 cm，以醫用膠布將導管與大鼠尾部固定。將大鼠置入透明有機玻璃固定盒中，蘇醒后適應10 min，首次使用0.1 mL擴張球囊10 s，間隔5 min后使用0.2 mL的球囊進行擴張(以后容積每次增加0.1 mL)。使用放置在腹部肌肉的同心圓電極記錄信號，以BL-420生物機能實驗系統收集并分析信號。

3.免疫熒光法：L6S1的DRG取材后置于4%多聚甲醛液，4 ℃過夜，包埋，切片，固定組織。置于1% Triton X-100中浸泡2 h，以3%過氧化氫消除內源性過氧化酶15 min。PBS洗滌，封閉。加入購自Abcam公司的兔抗TRPV1(工作濃度為1∶200)、鼠抗VGLUT2(工作濃度為1∶1 000)和兔抗VGLUT3(工作濃度為1∶200)4 ℃孵育過夜；加入購自Abcam公司的熒光標記的二抗羊抗兔(工作濃度為1∶2 000)和羊抗鼠(工作濃度為1∶2 000)37 ℃孵育30 min。DAPI封片后于激光共聚焦顯微鏡下采集圖像并行定量檢測分析。

為觀察L6S1 DRG中TRPV1與VGLUT2/3的相關性，6只大鼠行CRD前15 min神經鞘內預注射TRPV1拮抗劑SB366791(100 μmol/L，美國Selleck公司)，6只大鼠注射0.9%NaCl溶液作為對照組，觀察兩者的熒光活性。

4.蛋白質印跡法：將大鼠麻醉后處死，快速分離L6S1段脊髓，-80 ℃保存。取各組組織，提取蛋白質，調整各樣本蛋白總量，行10% SDS-PAGE電泳，分離蛋白后電轉移至PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，加入兔抗TRPV1(工作濃度為1∶500)、鼠抗VGLUT2(工作濃度為1∶1 000)、兔抗VGLUT3(工作濃度為1∶500)、β-actin(工作濃度為1∶1 500)(均購自英國Abcam公司)4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，再分別與HRP標記的羊抗鼠和羊抗兔二抗(工作濃度為1∶1 000)室溫避光孵育1 h，染色條帶曝光顯影，以目的條帶與β-actin的比值作為目的蛋白的表達。

5.16S rDNA序列分析：大鼠新鮮糞便采用QIAamp快速DNA糞便試劑盒(Qiagen)分離微生物基因組DNA，對DNA的16S V3～V4區進行PCR擴增。正向引物：5’-ACT CCT ACG GGR SGC AGC AG-3’，反向引物：3’-GGA CTA CVV GGG TAT CTA ATC-5’。以稀釋后的基因組DNA為模板，使用KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR試劑盒(羅氏公司)高保真酶進行PCR，確保擴增的準確性和高效性。使用Illumina HiSeq 2500進行上機測序。

三、統計學分析

結 果

一、內臟敏感性

擴張容積為0.1、0.4 mL時，各組間EMG相比無明顯差異(P>0.05)。擴張容積為0.2、0.3 mL時，WAS組EMG均顯著高于對照組(P=0.000；P=0.004)，利福昔明組又顯著低于WAS組(P=0.015；P=0.005；圖1、表1)。

二、TRPV1和VGLUT2/3免疫活性

免疫熒光法顯示，與對照組相比，WAS組大鼠L6S1 DRG中TRPV1和VGLUT2/3免疫活性信號明顯增強(P=0.03;P=0.013;P=0.01)；與WAS組相比，利福昔明能明顯減少TRPV1和VGLUT2/3的免疫活性信號(P=0.006;P=0.007;P=0.018；圖2、表2)。

以TRPV1拮抗劑預處理后，大鼠L6S1 DRG中VGLUT2/3免疫活性明顯降低(VGLUT2: 191.33±29.12對132.72±13.04,P=0.014; VGLUT3: 46.78±12.68對27.22±5.94,P=0.025；圖3)。

三、TRPV1和VGLUT2/3蛋白表達

蛋白質印跡法顯示，與對照組相比，WAS組L6S1段脊髓中TRPV1和VGLUT2/3蛋白表達明顯增加(P=0.02;P=0.02;P=0.02)。與WAS組相比，利福昔明組TRPV1和VGLUT2/3蛋白表達明顯減少(P=0.02;P=0.04;P=0.03；表3、圖4)。

四、腸道菌群分析

利福昔明組、WAS組和對照組大鼠腸道菌群的主要類型分別為Spirochaetaies、Bacillales和Anaero-truncus(圖5A)。在屬水平上，Treponema、Alistipes、Bifidobacterium、Anaerotruncus和Gemella對三組大鼠腸道菌群的影響較大。與對照組相比，WAS組和利福昔明組在屬水平上Treponema和Alistipes的相對豐度明顯下降(P<0.05；圖5B)。Alpha多樣性分析結果顯示，與對照組相比，WAS組Shannon指數明顯降低(4.28±0.38對6.19±0.35,P=0.002 7)；利福昔明組顯著高于WAS組(5.99±0.29對4.28±0.38,P=0.001)。

圖1 各組CRD后內臟運動反射的肌電活性

表1 各組大鼠CRD后內臟運動反射的肌電活性

*與對照組比較，P<0.05；#與WAS組比較，P<0.05

圖2 各組大鼠L6S1 DRG中TRPV1和VGLUT2/3的免疫熒光活性

圖3 TRPV1受體拮抗劑對大鼠L6S1 DRG中TRPV1和VGLUT2/3免疫熒光活性的影響

表2 各組大鼠TRPV1和VGLUT2/3免疫活性

*與對照組比較，P<0.05；#與WAS組比較，P<0.05

表3 各組大鼠TRPV1和VGLUT2/3蛋白表達

*與對照組比較，P<0.05；#與WAS組比較，P<0.05

*P<0.05

討 論

腸道菌群在大鼠內臟痛覺過敏中起有關鍵作用，本研究結果表明慢性WAS誘導的腸道菌群紊亂會導致周圍和中樞神經元TRPV1-VGLUT2/3通路激活，從而導致內臟痛覺過敏，抗菌藥物利福昔明能改善WAS所致的大鼠內臟高敏感。

腹痛是IBS患者常見的癥狀之一，內臟痛覺過敏是引起腹痛的重要因素之一，可引起從腸道到大腦的信號被夸大。本研究中，當擴張容積分別為0.2 mL和0.3 mL時，WAS組的肌電活動較對照組明顯增加，給予利福昔明后可明顯降低應激引起的肌電活動。說明即使輕度刺激也能引起WAS大鼠內臟痛覺，利福昔明主要作用是能提高引起WAS的痛覺閾值。但當擴張容積超過0.4 mL時，各組間肌電活性無明顯差異。

腸道菌群是一個龐大的生態系統，在人體中發揮多種功能。研究表明腸道菌群在調節腸道功能中起有重要作用，IBS患者與健康組腸道菌群存在顯著差異[7]。近年研究表明益生菌對IBS患者有一定的療效[8-9]。利福昔明已被FDA批準用于IBS的治療，可有效改善腹痛[4,10]。本研究中，與對照組相比，WAS組和利福昔明組在屬水平上Treponema和Alistipes菌的相對豐度明顯下降。利福昔明對應激大鼠腸道菌群相對豐度的作用還應增加樣本數行進一步研究證實。

細菌可通過不同的機制在痛覺感受器神經元中觸發鈣通道和動作電位。羅伊桿菌(DSM 17938)可降低辣椒素和空腸脊髓神經動作電位擴張誘發的激發反應，其中80%的反應被TRPV1通道拮抗劑所阻斷[11]。腸道菌群紊亂會改變結腸初級傳入神經元中的神經遞質，從而導致內臟直覺的改變。有研究發現，TRPV1是新霉素的靶點，腹腔內新霉素給藥可抑制內臟痛覺[12]。VGLUT2主要在痛覺初級傳入神經元中起主導作用[13]。在神經元末梢中VGLUT3能將胞質中的神經遞質谷氨酸逆濃度轉運至囊泡。在DRG中，TRPV1和VGLUT3陽性神經元均為C-和Aδ-類纖維。在DRG、脊髓以及大腦黑質、海馬中，辣椒素能增加突觸前Ca2+釋放，增強突觸前TRPV1的活性和谷氨酸的釋放[14-15]。研究顯示，VGLUT3可能與機械和內臟痛覺過敏密切相關[6]。研究還表明，VGLUT2在TRPV1熱痛覺過敏中發揮重要作用[14]。本研究結果顯示，WAS大鼠TRPV1和VGLUT2/3表達顯著增加，而利福昔明可抑制其升高。給予TRPV1拮抗劑后，大鼠外周神經元VGLUT2/3顯著降低。因此，推測腸道菌群失衡可激活TRPV1通道，從而誘導VGLUT2/3釋放神經遞質谷氨酸，導致大鼠內臟痛覺過敏。

圖5 各組腸道菌群差異分析

總之，利福昔明可能是通過腸道菌群和TRPV1-VGLUT2/3通道來改善大鼠內臟高敏感，但該研究結論仍需行進一步研究證實。