土壤耐鉻細菌的篩選及特性研究

陳少金 劉仕柏 梁健敏 彭昌盛 姜學霞

摘要：本項目從土壤微生物生態修復的角度，利用細菌分離培養的研究方法，對重金屬鉻（Cr）污染土壤的微生物的生態效應和重金屬鉻修復作用進行研究，探究功能菌對Cr6+的轉化機理和響應機制，為微生物修復技術的應用提供科學依據。

關鍵詞：農田土壤;重金屬;微生物;鉻

中圖分類號：X131.3 文獻標識碼：A 文章編號：2095-672X（2019）12-00-02

Abstract：In this project， from the Angle of the soil microbial ecological restoration using bacteria cultivation methods， chromium （Cr） of heavy metals by heavy metals pollution in soil microbial ecological effect and action of chromium to study， to explore the function of microbes the transformation mechanism of Cr6 + and response mechanism， which will provide a scientific basis for the application of bioremediation.

Key words：Farmland soill;Heavy metal pollution;Microorganism;Cr

在土壤污染問題中，重金屬污染是治理之重。土壤中六價鉻污染的主要來源是電子產品拆解工廠在拆解作業中，沒有進行適當的處理，從而導致產品內部的重金屬鉻釋放到土壤環境中去，或者合金冶煉過程中產生的鉻酸煙霧，經過重力沉降進入土壤中，以及制革工業生產過程中產生的剩余制革污泥因處理不當等原因釋放到土壤環境中去。重金屬鉻污染對土壤生態系統的危害巨大[1]。土壤中的重金屬鉻與人類健康和動植物生長狀況緊密相關，Cr是生物生長發育過程中必須的微量元素之一。適量的鉻可以促進生物的生長，但同時鉻屬于五毒元素之一，若土壤環境中的重金屬鉻嚴重超標，植物體內的葉綠素結構會被破壞，導致植物生長不良;另一方面高濃度的重金屬鉻可能會通過食物鏈和食物網最終進入人體，對人體具有致癌、致畸變、致突變的作用[2]。另外，鉻污染導致土壤結構和理化性質發生改變，嚴重破壞了土壤環境的生態平衡。

利用土壤微生物對重金屬的吸附和還原作用，可用于吸附土壤中的重金屬鉻或將毒性較強的六價鉻還原為毒性較弱的三價鉻，某些功能微生物對重金屬鉻污染具有一定的耐受程度，可利用微生物吸附及富集、降解、氧化還原和降毒等機理使得土壤中的重金屬轉化為遷移性能差，毒性低的狀態[3]。土壤重金屬污染的傳統治理方法多樣，相比之下，微生物法治理具有更高的經濟效益和生態效益，微生物修復土壤重金屬對土壤理化性質和結構影響相較于物理、化學和物理化學等技術小。微生物具有個體小、繁殖速度快、代時短數量大等優點，有利于微生物的培養，隨著技術的進步，可培養和馴化出對某種重金屬處理效率高和具有針對性的功能微生物，不會對土壤造成二次污染，修復過程是可持續的，有利于維護土壤生態平衡。從經濟的角度而言，由于微生物增殖速度快，微生物修復技術成本低，具有較大的發展前景。

1 材料與方法

1.1 采樣

利用梅花形布點法采集距離地面0～20 cm耕作層土壤，將在一個采樣單元內各采樣點采集的土樣混合均勻制成混合樣，利用四分法棄取，最后留下1 kg裝入樣品袋中，并貼好標簽帶回實驗室進行土樣預處理。土壤樣品經自然風干、磨碎、過篩、混合、分裝，進行化學分析。將風干的土樣在有機玻璃板或在木板上用錘、棍、棒壓碎，并除去碎石、砂礫及植物殘體后，用四分法分取所需土樣量，使其全部通過20目孔徑尼龍篩。過篩后的土樣全部置于聚乙烯薄膜上，充分混勻，采用四分法兩兩混合分成兩份，一份放于樣品庫存放，用于土壤pH、土壤交換量等項目的測定;另一份繼續采用四分法兩兩混合縮分成兩份，一份備用，另一份充分研磨至全部通過60目孔徑尼龍篩，充分混合均勻后備用。

1.2 土壤Cr6+的測量

標準曲線的繪制參照二苯碳酰二肼分光光度法。取9支50 mL比色管，依次加入0、0.20、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00和10.00 mL鉻標準使用液（每毫升標準使用液含1.00 μg Cr6+），用蒸餾水稀釋至標線，加入（1+1）硫酸0.5 mL和（1+1）磷酸0.5 mL，搖勻。加入2 mL顯色劑溶液，搖勻。顯色5～10 min后，于540 nm波長處，用1 cm比色皿，以水為參比，測定吸光度并作空白校正。以吸光度為橫坐標，相應Cr6+含量為縱坐標繪出標準曲線（圖1）。

1.3 功能菌的篩選、馴化與鑒定

利用牛肉膏-蛋白胨培養基（細菌）進行耐鉻細菌的分離純化，采用梯度稀釋法分離目的菌株，然后采用平板劃線法來純化菌株直至出現單個菌落為止（圖2）。將單個菌落菌株接種到1mg/L Cr6+離子的液體培養基中，然后置于30℃，135r/min條件下搖床培養24h，篩選出耐鉻菌作為種子液。取0.25mL的1g/L的Cr6+溶液到250ml帶棉塞錐形瓶中并加入249.75 mL的液體培養基即配成濃度為1mg/L Cr6+離子的液體培養基，按此方法配制濃度分別為10mg/L、20mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L……250 mg/L、300 mg/L的一系列液體培養基。將上述培養出來的種子液菌株分別接種到濃度梯度液體培養基上，然后置于30℃，135r/min條件下搖床培養24h，記錄菌株最高耐受度。本實驗篩選出兩株功能菌，分別命名為1號（白色菌落）和2號（紅色菌落），最后進行冷凍保存，主要研究了2號紅色功能菌對20 mg/L和 40 mg/L濃度的Cr6+離子的去除效果。