CRISPR/Cas9基因編輯技術在腫瘤研究及治療中的應用

王韶嶸綜述 高興春 陳芳妮 喬文偉 米亞靜審校

作者單位：710021西安醫學院公共衛生學院(王韶嶸，陳芳妮)；710021西安醫學院基礎醫學部(高興春，米亞靜)；710021西安醫學院臨床醫學院(喬文偉)

惡性腫瘤嚴重威脅著我們的健康，根據國家癌癥中心發布的全國癌癥統計數據顯示，2014年我國惡性腫瘤估計新發病例數380.4萬例(男性211.4萬例，女性169.0萬例)，2015年這一數字達到400萬。惡性腫瘤是由遺傳因素、環境因素及機體免疫系統等在內的多種因素共同作用下所引發的，其發病機制復雜，目前還不能完全闡明其具體機制。此外，惡性腫瘤的治療主要依賴于放、化療及手術治療，但對于放、化療均不耐受或已經處于晚期、失去手術機會的患者仍然沒有一種有效且具有特異性的治療方法，這些導致惡性腫瘤患者的治愈率不高且預后極差。CRISPR/Cas9基因編輯技術發展迅猛，具有廣泛的應用前景，研究人員開創性地將其應用到腫瘤的研究中，探索復雜的腫瘤表型與基因功能間的關系，為腫瘤的研究及治療提供了新的技術。

1 CRISPR/Cas9基因編輯技術

1.1 CRISPR發展歷程

1987年，日本科學家在研究堿性磷酸酶基因時發現該基因編碼區下游存在一系列的重復片段(Repeats)，中間以非重復片段(Spacers)間隔相連。這些片段的長度在24～48 bp不等，具有二重對稱性，為其形成發夾結構提供基礎。2002年，Jansen等[1]首次明確定義了細菌基因組中的CRISPR/Cas9系統。在2005年研究人員又發現CRISPR中的很多間隔序列來源于質粒或噬菌體外源DNA，因此提出了CRISPR/Cas系統可能是細菌的適應性防御系統的假說[2]。2007年，Barrangou等[3]第1次通過實驗驗證了CRISPR間隔序列可以通過與噬菌體相應序列的匹配來發揮適應性免疫反應。隨后CRISPR/Cas系統的作用機制逐漸被揭開，目前，CRISPR/Cas9技術作為一種快速高效的基因編輯技術，已被應用于人類細胞、小鼠、大鼠、斑馬魚、酵母、果蠅、現充、擬南芥、非洲爪蟾[4]等領域的研究中，發揮了不可忽視的作用。

1.2 CRISPR/Cas9系統作用機制

根據核酸內切酶的識別及切割機制的不同，CRISPR/Cas系統分成2類5型，共16個亞型[5-6]，在此主要介紹其中操作較為簡潔并且應用廣泛的來源于釀膿性鏈球菌的2類Ⅱ型CRISPR/Cas9系統。

CRISPR RNA(crRNA)、反式激活CRISPR RNA(trans-activating CRISPR RNA,tracrRNA)、Cas9蛋白是CRISPR/Cas9系統的3個重要組成要件。在外源DNA第1次入侵噬菌體或細菌時，CRISPR/Cas9系統會特異性的捕獲一段被稱為proto-spacers的外源DNA序列，整合入細菌CIRSPR序列形成位于目標位點下游的間隔序列鄰近基序(protospacer adjacent motif,PAM)。當同一外源DNA第2次進入細菌時，CRISPR/Cas9轉錄生成前體CRISPR RNA(pre-crRNA)，在RNaseⅢ的作用下被加工成為成熟crRNA。crRNA的3' 端通過堿基互補配對與tracrRNA形成雙鏈二級結構-R環，引導Cas9蛋白聚集在其周圍形成CRISPR核糖核蛋白復合體。復合體中crRNA的5' 末端特異性識別目標序列，同時識別PAM的NGG位點后，CRISPR/Cas9對外源DNA進行靶向切割，形成DNA雙鏈缺口(doubt strand breaks,DSBs)。DNA在自我修復的過程中優先使用易出現失誤的非同源末端連接(nonhomologous end-joining，NHEJ)，錯誤地引入堿基使DNA發生突變，就完成了基因敲除的目的。在切割過程中，PAM位點通常作為識別位點存在，而更重要的是PAM位點還是區別自身DNA與外源DNA防止發生自身免疫的識別位點。隨著研究的深入，研究人員用單鏈導向RNA(sgRNA)代替crRNA與tracrRNA形成的R環，同樣可以實現Cas9蛋白對目標基因定點切割的目的。

1.3 CRISPR與其他基因編輯技術的比較

除新型的CRISPR/Cas9技術外，基因編輯技術還有ZFN和TALEN。ZFN和TALEN作為基因編輯技術中不可或缺的方法，至今仍被廣泛應用，而CRISPR/Cas9技術作為新型基因編輯技術，有其自身的優勢：①可編輯位點多。理論上，在基因組中每8 bp就有1個合適CRISPR/Cas9編輯的位點[7]，分布頻率高，而對于ZFN和TALEN，在基因組中平均要500 bp和125 bp才會有1個合適的編輯位點。②切割復合體簡單。針對于不同的基因序列，ZFN需要設計不同的識別結構域，不僅操作復雜，還耗費時間、人力和財力；而CRISPR/Cas9技術只需要一段sgRNA即可識別目的序列發揮基因編輯作用。③可同時進行多個位點基因的編輯。研究者可以設計多條sgRNA引導序列，同時導入目的細胞即可同時編輯多個靶位點。有研究報道[8-10]，CRISPR/Cas9系統在小鼠和斑馬魚中可以同時編輯5個基因，在大鼠細胞中可以同時編輯3個基因。而ZFN和TALEN技術大多只針對1個目標靶點進行編輯，就這方面而言，CRISPR/Cas9編輯技術具有明顯的優勢。

2 CRISPR/Cas9基因編輯技術在腫瘤研究中的應用

CRISPR/Cas9系統作為新出現的一種基因編輯技術具有操作簡便、快速省時等優點，已經被研究人員廣泛應用到腫瘤的研究及治療中，并取得了令人鼓舞的結果。

2.1 建立癌癥動物模型

癌癥動物模型的建立是研究癌癥相關基因功能的一個重要手段。在傳統的動物模型建立中，研究人員的技術操作僅限于受精卵水平，利用同源重組技術對胚胎干細胞進行基因編輯。例如，研究人員通過一系列ES細胞操做或原核注射等方式對小鼠進行基因改造，篩選產生生殖系嵌合體的小鼠，進而培育出單基因敲除的小鼠。但是這種方法存在很多問題：獲得敲除小鼠的時限較長、飼養小鼠的成本高昂等。此外，不能同時在小鼠或者ES細胞中引入多種修飾基因，這仍然是限制該方法在疾病研究應用中的一大阻礙[11]。而CRISPR/Cas9技術則極大地簡化了癌癥動物模型的建立，該技術不需要建立復雜的ES細胞系，極大程度地縮短了時限、縮減了成本。2013年，Jenisch團隊證明了CRISPR/Cas9系統在單個步驟中可以在小鼠ES細胞中同時編輯5對(Tet1、Tet2、Tet3、Sry、Uty-8)基因，為獲得攜帶目的基因的小鼠提供了便利。

此外，科學家首次利用水流動力學注射，通過小鼠尾靜脈向野生型小鼠體內注射包含Cas9和gRNAs的質粒，靶向敲除肝細胞內的抑癌基因PTEN和p53，快速地獲得了患有肝癌的小鼠模型，有利于肝癌機制的研究的開展[12]。同年，在成功構建肝癌模型后，張峰團隊及Phillip A.Sharp團隊的Sidi Chen等又成功構建了小鼠肺癌模型[13]，他們首先利用Cre-loxP系統將Cas9基因敲入小鼠體內，構建Cas9小鼠模型后，將篩選出來的3個基因：KRAS、p53、LKB1基因的sgRNA分別轉導入小鼠體內，迅速獲得肺腺癌小鼠模型。

人們對于腦瘤的發病機制缺乏了解，導致對腦瘤的治療不能達到令人滿意的效果。2016年，Mao等首次利用CRISPR/Cas9技術建立了小鼠腦瘤模型，改善了傳統腦瘤動物模型中存在的問題，能夠更精確地進行腦瘤相關靶點的研究。同時，實驗中還確定了13種與腦瘤發病密切相關的一些調節因子(p53、Nf1、Pten、Ptech1、Bmi1、Met、Notch1、CDK6、miR-10b、TERT、LSD1、miR-218、miR-128)[14]。

2.2 癌癥發生發展的機制研究

在腫瘤的研究進程中，運用離體細胞培養的方式來研究腫瘤的發病機制是必不可少的。CRISPR/Cas9技術使得研究者可以更方便、更快捷地獲得腫瘤細胞系。在早期的研究中，研究者利用Cas9蛋白切割靶DNA，DNA雙鏈發生斷裂后有2種修復方式：非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)和同源末端連接(homologous directed repair，HDR)，其中NHEJ修復后產生插入或缺失突變，使DNA雙鏈發生移碼突變或無義突變，從而達到敲除基因的目的。汪超甲等[15]利用CRISPR/Cas9表達載體敲除了在神經膠質瘤細胞中高表達的Pyk2，抑制了膠質瘤細胞的增殖、遷移及侵襲能力，揭示了其在膠質瘤發生、發展的作用，為未來治療膠質瘤提供了理論基礎。

為了進一步提高CRISPR-Cas9系統的有效性，拓展CRISPR/Cas9系統在其他方面的應用。近幾年的研究發現了一種Cas9蛋白的突變體Nuclease-dead Cas9(dCas9)，這是一種喪失了核酸酶活性的Cas9蛋白，通過與DNA序列的結合阻止轉錄過程，進而實現對基因表達的抑制作用。這種具有dCas9的CRISPR系統被稱為CRISPR干擾(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat interference， CRISPRi)技術。該系統提供兩種不同的功能，一種為dCas9介導的抑制作用CRISPRi(例如KRAB)，另一種為dCas9介導的激活CRISPRa(例如VP16和VP64)[16]。利用這2個功能研究人員不僅可以通過敲除基因探究基因功能，還可以通過dCas9激活技術篩選、鑒定原癌基因，有助于發現新的基因治療靶點[17-19]，為未來腫瘤機制的研究提供重要的基礎。

3 CRISPR/Cas9基因編輯技術在腫瘤治療中的應用

3.1 基因修復及敲除

在腫瘤細胞形成的過程中，原癌基因的激活與抑癌基因的沉默均可以導致腫瘤的發生。恢復、提高抑癌基因的表達，就成為了一種治療腫瘤的新思路。慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML) 的發生常與體內抑癌基因ASXL1的突變有關，并且影響患者的預后。Simona等[20]利用CRISPR/Cas9技術靶向修復了KBM5細胞中ASXL1的無效突變，顯著降低了KBM5細胞的增殖速率，增強了細胞的分化，并且經過ASXL1基因修復的荷瘤小鼠的生存時間較未經ASXL1修復的荷瘤小鼠生存時間長。

此外，由于表觀遺傳學在腫瘤發生中的重要作用，通過表觀遺傳學與CRISPR/Cas9系統影響腫瘤發生發展過程中的關鍵基因的表達，可能成為未來很有價值的一種腫瘤治療手段。例如，表觀遺傳修飾與dCas9融合或由scRNA招募到目標位點，通過改變目標位點的甲基化狀態或者以特定的方式影響其對組蛋白的修飾，實現對腫瘤進行治療的目的。

3.2 打破機體免疫耐受

腫瘤細胞在體內通過對自身的組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)進行修飾從而建立免疫耐受，逃逸免疫系統的殺傷，因此研究人員通過打破其免疫耐受實現治療的目的。目前腫瘤細胞免疫治療的方法包括：特異性T細胞受體修飾的T細胞治療(TCR-T)和嵌合抗原受體修飾的T細胞治療(CAR-T)。這兩種免疫治療方法都是通過在T細胞的表面表達特異性受體，從而發生特異性識別、殺傷靶細胞的免疫應答反應，其中CAR-T技術在治療血液腫瘤和非霍奇金淋巴瘤上有顯著療效。但這種方法會導致CAR基因隨機插入到受體細胞的基因組上，可能引起遺傳副作用的發生。因此，2017年Eyquem Justin等利用CRISPR/Cas9技術構建了新一代CAR-T細胞[21]。CRRISPR/Cas9系統通過編輯T細胞中的TRAC(T-cell receptor a constant)基因，將CAR基因特異性地插入到受體細胞基因組，避免了遺傳副作用的發生、增強了T細胞的效力，并且延遲了效應T細胞的耗竭。這一結果也在急性淋巴細胞白血病的小鼠模型中得到了驗證。

此外，研究人員還利用CRISPR/Cas9編輯技術敲除PDCD1基因實現了腫瘤免疫治療。在人體腫瘤微環境中，程序性死亡受體(programmed cell death protein 1，PD-1)是由PDCD1基因編碼的產物，在人體抗腫瘤免疫應答機制中起負向調節的功能，通過阻斷PD-1與其受體PD-L1的結合，增強人體T細胞的激活來發揮其生物作用。2017年，陳艷新等[22]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除人體T細胞系HuT-78中PDCD1基因，下調了PD-1的表達，因而減弱了PD-1/PD-L1信號通路對細胞免疫功能的抑制作用，使T細胞對腫瘤的殺傷能力不受影響，為未來腫瘤的免疫學治療提供有力的技術支持。

綜上所述，CRISPR/Cas9技術在未來腫瘤研究及治療方面的發展潛力是無限的， 但是我們必須清醒地認識到，這項技術還存在很多尚未解決的問題，比如嚴重的脫靶效應，應用于人體時的倫理問題、安全性問題等。但可以預見的是，隨著CRISPR/Cas9技術的不斷創新最終會解決上述難題，為腫瘤的治療研究提供新的思路和方向，為腫瘤患者帶去新希望。