高效液相色譜法檢測奶牛血清中脂肪酸濃度測定

錢 坤

（天津市農業生態環境監測與農產品質量檢測中心，天津 300402）

高效液相色譜法是一種科學有效的檢測方式，在奶牛血清中脂肪酸濃度測定中應用效果顯著，可以有效的提升測量的精準度，解決了氣相色譜法檢測的問題與不足，具有穩定高效的特征。

1 高效液相色譜法檢測奶牛血清中脂肪酸濃度測定實驗

奶牛在分娩之前2周直至娩之后的10d左右，血漿中脂肪酸濃度會呈現一定的波動變化，一般會在平均0.2mmol/L 逐漸增加到0.75mmol/L左右，而患酮病奶牛血液中的脂肪酸濃度則就會高達1mmol/L左右。脂肪酸代謝紊亂會影響奶牛的胰島素抵抗以及細胞免疫等問題，通過高效液相色譜法進行奶牛血清中脂肪酸濃度測定，可以為脂肪酸代謝紊亂的控制提供參考與支持。通過氣相色譜法進行脂肪酸代謝檢測，因為溫度高，很容易導致不飽和脂肪酸在檢測中出現異構化的問題，隨著各種技術手段的成熟，通過HPLC奶牛血清中脂肪酸濃度測定的研究也逐漸增多。

1.1 材料

選擇健康奶牛作為試驗動物；根據要求進行試劑配制處理。

1.2 血漿脂肪酸提取

將0.25ml血清放入到10ml離心管之中，然后分別添加25μl內標溶液以及1.25ml提取液，對其進行旋渦處理，時間為10min；處理之后添加1ml正庚烷、0.75ml水，對其渦旋處理，時間為5 min。通過 4500r/min 離心處理 5 min，獲得上層正庚烷溶液，將其放在4ml玻璃瓶之中，在離心管中添加1ml正庚烷，對其渦旋處理5min，通過4500r/min 離心處理5min，與上層正庚烷溶液進行合并，通過氮氣進行吹干獲得樣品小瓶。

1.3 標準曲線的制備

分別取對照品50μl、100μl、200μl、400μl、800μl工作溶液，將其放在4ml玻璃瓶之中，分別添加25μl的內標溶液，通過氮氣將其吹干，獲得標準曲線樣品小瓶。

1.4 脂肪酸的衍生化

在小瓶中或者標準曲線小瓶中的，加入2-溴苯乙酮丙酮溶液50μl以及三乙胺溶液50μl，通過添加300μl丙酮，要蓋緊螺旋蓋，對其震蕩處理1min，將其放在95℃的干燥箱中進行反應，15min之后取出之后將其冷卻；然后添加75μl的醋酸丙酮溶液，將其震蕩1 min之后，將其放在95℃中進行干燥箱反應處理5 min，然后將其冷卻處理，通過氮氣吹干處理，通過0.5ml的甲醇復溶將其進行微孔濾膜處理，放置1.5ml的上機小瓶中進行處理。

1.5 精密度試驗

取0.25ml的血清進行精密量處理，根據規范要求進行五次處理，計算分析脂肪酸的濃度，并且計算相對標準偏差。

1.6 加樣回收率試驗

取0.25ml血清添加100μl對照品的工作融合，將其混勻之后，根據以上方法進行三次處理，獲得標準曲線，計算各脂肪酸濃度，計算回收率。

2 奶牛血清中脂肪酸濃度測定結果

2.1 色譜圖

8種脂肪酸混合標準品均達到了基線分離。奶牛血清樣品色譜圖中可以發現在25min以及32min的時候存在未定義峰，通過推測分析其可能是正-十二烷酸以及亞麻酸。并未檢測到達奶牛血清的二十二碳六烯酸。

2.2 標準曲線

根據內標法計算分析脂肪酸標準曲線，分析對照品與內標物濃度比值、峰面積比值可以發現二者在線性范圍中的相關系數均高于0.999。根據標準曲線計算分析脂肪酸最小定量限為0.01～0.22mg/L；其最小檢測限為0.03～0.67mg/L。

2.3 精密度與回收率

分析精密度以及加樣回收率，通過分析發現在實驗中尚未檢測出C22∶6。而C20∶5的 濃度則小于線性范圍，通過增加取樣量或者降低 C20∶5 的方式進行分析，提升檢測精準性。其精密度RSD≤2.96%，而回收率則主要在 96～99% 區間范圍中，此種方式精準、穩定。

3 討論分析

3.1 衍生化方法

通過紫外線檢測器進行脂肪酸的衍生化反應檢測分析。通過2-溴苯乙酮作為主要的衍生化試劑，此種方式操作簡單便捷，其產物相對較為穩定。在60min中則可以完全出峰。在處理中乙腈、丙酮以及正己烷都是性能良好的衍生化反應介質，而水分則就會降低反應得率，在此次實驗中通過干燥箱加熱的方式進行衍生化反應處理。

Wood 等學者明確的指出了如果2-溴苯乙酮過量則就會導致其與色譜柱中的填料產生作用。一些在其他任何富集在柱之上的帶羧基化合物都會產生反應，這樣就會對色譜峰檢測產生一定干擾處理，為了提升檢測的精準度。在衍生化處理之后要通過添加醋酸的方式進行衍生計處理，這也是影響試驗結果的重要參數。

3.2 檢測波長

通過SPD-16檢測器進行光譜掃描功能處理，實現對脂肪酸衍生化產業的光譜掃描，確定其最大的吸收波長委托243.7mm，因此要通過244mm作為檢測的波長。

4 結語

通過0HPLC 方法進行奶牛血清中脂肪酸濃度測定分析，其精密度較高，可以滿足回收率的質量控制標準要求，可以為奶牛血清中脂肪酸含量檢測提供支持。為奶牛脂肪酸紊亂的控制與檢測提供了技術支持。