HPLC法測定安乃近注射液有關物質

劉曉丹 烏日罕 畢力格 阿迪亞 王惠英

（內蒙古自治區獸藥監察所，內蒙古呼和浩特 010000）

安乃近注射液為解熱鎮痛類藥，用于肌肉痛、關節痛、偏頭痛、風濕癥等。安乃近注射液現收載在《中國獸藥典》2015年版一部上，標準中未對有關物質進行控制檢測。安乃近性質不穩定，光、熱、酸、堿均可使其分解，主要降解產物為4-甲氨基安替比林。國內企業大多采用4-甲氨基安替比林與羥基次甲基磺酸鈉縮合的方法生產安乃近，由于由多步化學反應過程組成，每一步幾乎都有副反應發生，最終產品可能積累了多種化學雜質。《中國獸藥典》2015年版一部安乃近原料藥和安乃近片有關物質采用反相高效液相色譜法，色譜柱為C18，以磷酸鹽緩沖液（磷酸二氫鈉 6.0g，加水1000ml，加三乙胺1ml，用氫氧化鈉溶液調節pH值至7.0）-甲醇（75：25）為流動相，檢測波長254nm。蔡濤等人采用反相高效液相色譜法，色譜柱為C18，以磷酸鹽緩沖液（磷酸二氫鈉6.0g，加水1000ml，加三乙胺1ml，用氫氧化鈉溶液調節pH值至7.0）-甲醇（74：26）為流動相，檢測波長為246nm，檢測安乃近注射液中有關物質。我們按照《中國獸藥典》2015年版一部安乃近原料藥和安乃近片有關物質的檢測方法開展試驗，本文可用于安乃近注射液有關物質控制檢測，同時對樣品中的安乃近注射液有關物質進行了考察。

1 儀器與試藥

Waters e2695高效液相色譜儀；十萬分之一分析天平（Mettler Toledo）；萬分之一分析天平（Mettler Toledo）；甲醇（色譜純，Merck）；磷酸二氫鈉（天津市大茂化學試劑廠）；4-甲氨基安替比林（批號：101115-201101，中國食品藥品檢定研究院）。實驗中所用的水均為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜條件：Waters XBridge C18（4.6 mm × 150 mm，5um）色譜柱，流動相為磷酸鹽緩沖液（磷酸二氫鈉6.0g，加水1000ml，加三乙胺1ml，加氫氧化鈉溶液調pH至7.0）-甲醇（75︰25），流速為1.0 ml/min，檢測波長254nm，進樣量10μl，柱溫30℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取4-甲氨基安替比林對照品約10mg，加甲醇溶解并定容至200ml量瓶中，搖勻，即得。

2.2.2 樣品溶液的制備

取安乃近注射液樣品（批號：C10181001 河北遠征禾木藥業有限公司）2.5ml，加甲醇定容至150 ml量瓶中，搖勻，即得。

2.3 系統適用性考察

精密稱取安乃近和4-N-去甲基安乃近對照品各12.5mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，精密量取5ml置50ml量瓶中，加甲醇定容至刻度。在2.1項下色譜條件下，進樣測試，記錄液相色譜圖。結果安乃近峰與4-N-去甲基安乃近峰的分離度為3.9，能夠符合系統適用性要求。

2.4 定量限考察

取2.2.1項下的對照品溶液，用甲醇逐級稀釋成系列濃度的溶液，按2.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖，以信噪比10：1為定量限。結果4-甲氨基安替比林定量限為0.4μg/mL。

2.5 線性關系考察

精密稱取4-甲氨基安替比林對照品約40m g，配制成對照品系列濃度，按2.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖。以4-甲氨基安替比林溶液濃度為橫坐標（X），以相應的峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線。結果4-甲氨基安替比林質量濃度 在 0.0004076 ～ 0.4075 mg/ml（Y=2.43e+007X-3.27e+003，R2=0.9999）與峰面積積分值呈良好的線性關系。

2.6 專屬性考察

2.6.1 干擾試驗

溶劑空白：甲醇作為溶劑空白；對照品溶液：精密稱取4-甲氨基安替比林對照品約10mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度；樣品溶液：同2.2.2項下。分別取上述對照品溶液、溶劑空白、樣品溶液各10 μl進樣測試，得到4-甲氨基安替比林保留時間。

結果對照品溶液4-甲氨基安替比林的保留時間為14.547min，樣品溶液4-甲氨基安替比林的保留時間為14.552min，表明對照品溶液和樣品溶液中4-甲氨基安替比林的保留時間基本一致。在溶劑空白圖譜中，安乃近峰及4-甲氨基安替比林峰處無干擾。

2.6.2 破壞性試驗

取6份安乃近注射液樣品溶液各2.5～150 ml容量瓶中。其中一份不作處理，將其他5份安乃近注射液樣品溶液分別進行鹽酸降解、氫氧化鈉降解、100℃水浴降解、過氧化氫降解和光照降解。取上述溶液，在2.1項下的色譜條件下進樣，考察降解情況。結果樣品溶液在酸、堿、高溫、氧化和光照下降解，破壞量（主峰面積下降%）范圍是6.7～51.4%，主峰純度角均小于主峰純度閾值，均為單一物質峰。結果表明，該方法專屬性良好。

2.7 精密度考察

2.7.1 重復性考察

取2.2.1項下的對照品溶液和2.2.2項下的樣品溶液各10μl，在2.1項下的色譜條件，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果4-甲氨基安替比林為標示量的百分含量平均值為2.7%，RSD為0（n=6），表明該測定方法重復性良好。

2.7.2 進樣精密度考察

取2.2.1項下的對照品溶液10μl，連續進樣6次。結果4-甲氨基安替比林峰面積RSD為1.0%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7.3 中間精密度考察

精密量取2.2.2項下的樣品溶液10μl，由不同的檢測人員在不同日期分別配制樣品溶液，連續進樣6次，記錄色譜圖。結果甲、乙兩個檢驗人員測得4-甲氨基安替比林峰面積的RSD（n=6）分別為0.5%和0.6%，表明儀器中間精密度良好。

2.8 耐用性考察

取2.2.1項下的對照品溶液和2.2.2項下的樣品溶液10 μl進高效液相色譜儀，通過改變溫度、改變流速、改變酸堿度、更改流動相比例、更換色譜柱，分別記錄對照品溶液和供試品溶液的峰面積，計算4-甲氨基安替比林為標示量的百分含量。結果通過改變溫度、改變流速、改變酸堿度、更改流動相比例、更換色譜柱等條件，4-甲氨基安替比林為標示量的百分含量均為2.7%，說明該方法耐用性良好。

2.9 回收率考察

精密量取2.2.2項下的樣品溶液1 ml，加入4-甲氨基安替比林對照品，記錄4-甲氨基安替比林的峰面積，計算4-甲氨基安替比林的回收率。由表1可知，4-甲氨基安替比林的回收率為97.35～101.16%，平均回收率為99.9%，RSD為1.7%，表明符合方法學要求。

表1 回收率實驗結果

2.10 穩定性考察

取同一批樣品為考察對象，分別在1、2、4、8、16、24 h考察其穩定性，在2.1項下的色譜條件下進樣，記錄4-甲氨基安替比林的峰面積。結果4-甲氨基安替比林的峰面積RSD為1.8%（n=6），表明樣品溶液在24h內穩定性良好。

2.11 有關物質的測定

取市場抽檢的47批次樣品，按2.2.1和2.2.2項下配制對照品溶液和樣品溶液，在2.1項下色譜條件進樣測試。由表2可知，4-甲氨基安替比林小于標示量3.0%的有3家企業的6批次樣品，占比12.7%；4-甲氨基安替比林在標示量3.0～4.0%（含3.0%）之間的有6家企業7批次樣品，占比14.9%；4-甲氨基安替比林在標示量的4.0～5.0%之間的有2家企業2批次樣品，占比4.2%；4-甲氨基安替比林在標示量的5.0～6.0%之間的有4家企業4批次樣品，占比8.5%；4-甲氨基安替比林在標示量的6.0～7.0%之間的有7家企業10批次樣品，占比21.3%；4-甲氨基安替比林在標示量的7.0～8.0%（含7.0%）之間的有11家企業18批次樣品，占比38.3%。 其中46批次產品其他各雜質峰面積的和均小于對照溶液中安乃近峰面積（1.0%），占比97.9%。

3 討論

本文建立了測定安乃近注射液有關物質的方法，擬訂的安乃近注射液有關物質檢測方法經方法學驗證證實可行，簡便、快捷、穩定性好，重復性好，回收率高。我們測定的47批次產品全部來源于市場抽檢，產品批號涵蓋2017～2019，隨機性強，真實反映安乃近注射液有關物質狀況。該方法可用于安乃近注射液有關物質的質量控制。

表2 有關物質試驗結果