陽離子聚合物基因載體的研究進展

張寶臻，余澗坤

(1中國醫科大學第二臨床學院，沈陽110004；2中國醫科大學藥學院)

基因治療是將基因轉染到目標細胞中，通過目的蛋白質的表達，使相應疾病狀態得以減輕或糾正，最終達到治療疾病的目的。病毒類基因載體可以將外源基因導入細胞并高效表達目的基因，是目前臨床治療采用的主要載體。但是該類載體具有較高的免疫原性，病毒組件激活還會導致病毒相關疾病的發生，而且基因組容量也有限。因此，基于臨床多次給藥的特點及用藥安全性的要求，非病毒類基因載體更適合作為基因治療的運載工具。陽離子聚合物基因載體是近年來非病毒類基因載體領域研究的熱點,常見的陽離子聚合物基因載體有聚乙烯亞胺(PEI)、聚氨基胺(PAAs)、聚氨基酯(PAEs)和天然生物相容性高分子材料等。本文綜述了這幾類載體的物理化學性質、結構修飾等優化策略，總結此類載體在現階段研究中存在的問題，為基因載體的設計和構建提供新的思路。

1 PEI基因載體

1.1 PEI基因載體的物理化學性質 PEI單體(-CH2-CH2-NH-)中每3個原子含有1個氮原子，構成具有伯胺、仲胺、叔胺基團的水溶性聚合物。這些胺基的pKa值不同，使PEI在較寬的pH范圍內具有吸收質子的能力(即“質子海綿”作用)。PEI吸收H+使整個聚合物變成核正電，使得PEI具有較強結合核負電DNA和黏附細胞的能力；同時PEI吸收H+使內涵體滲透壓增高，導致內涵體膜不穩定甚至破裂，有效幫助目的基因片段實現“內涵體逃逸”，避免目的基因在溶酶體內降解，才能攜帶目的基因片段進入細胞核。因此PEI有較高的轉染效率[1]，常作為基因載體研究的陽性對照組。

PEI包載外源基因形成復合物的最佳分子量為5～25 kDa。高分子量PEI較低分子量PEI的轉染效率更高，但高分子量PEI往往有較高的細胞毒性。研究發現，相近分子量的支化PEI的目的基因片段包載能力、轉染效率均優于線形PEI，因此支化PEI更適宜作為非病毒類基因載體進行應用，而且PEI中伯胺基團越多則形成的基因載體復合物越穩定。

1.2 PEI基因載體的結構修飾 對PEI載體的結構修飾主要集中在優先對該類載體的末端伯胺基的修飾。研究表明，聚合物伯胺和仲胺的乙酰化修飾，能夠通過降低聚合物的胞質緩沖能力和穩定性，進而增加目的基因片段在胞質中的釋放；聚合物中仲胺和叔胺基團的數目越多，載體對外源基因的包封率越大，從而可能產生較高的轉染效率。Thomas等[2]研究發現，用丙氨酸或十二烷基對聚合物的末端伯胺基團進行修飾，能得到高效低毒的聚合物基因載體。通過對聚合物載體進行交聯或側鏈修飾來引入可生物降解的具有生物響應性的化學鍵，會影響載體在體內的降解、消除，進而影響目的基因的釋放和載體的細胞毒效應。例如:引入二硫鍵、亞胺鍵、酯鍵將低分子量的PEI連接起來，形成線形或分枝狀結構的高分子量PEI，由于這種衍生物具有較多的可生物降解的化學鍵，使其在體內可降解成低毒或無毒的低分子量PEI，這樣在具有較高轉染效率的同時，兼顧了較低的細胞毒性。

1.3 PEI基因載體的靶向修飾 采用生物活性基團特異性配體直接修飾PEI主鏈，制備具有特異性靶向功能的PEI軛合物載體。除了低分子量PEI自身偶聯外，另一種對PEI載體進行修飾的方法是通過引入特異性配體，通過配體間特異性的疏水作用實現聚合物各組件之間的物理吸引，從而改變其空間結構以獲得高效低毒的新載體，例如PEG-生物素/生物素抗體-PEI、PEI-環糊精/棕櫚酸酯-胰島素等。Liu等[3]將低分子量PEI和肌醇(INO)交聯，并與半乳糖接枝的PEG接合形成共聚物LA-PegPI，該載體顯示出了優異的體循環穩定性和較低的細胞毒性，在去唾液酸糖蛋白受體陽性的肝細胞中具有高轉染效率。低分子量PEI與β-環糊精和丙烷-1,2,3-三醇交聯形成共聚物后，此共聚物在B16-F0細胞中使裸DNA的轉染效率提高了700倍。除了B16-F0細胞，該聚合物還能在HepG2和U87細胞實現目的基因片段的高效遞送，轉染效率較高，細胞毒性較低[4]。因此，引入共價鍵的結構修飾，尤其是引入特異性配體等生物功能性基團的共價修飾在現階段研究中仍占主導地位。

2 PAAs基因載體

2.1 PAAs基因載體的物理化學性質 溶解度是PAAs基因載體的重要性質，多數載體能夠溶于水、有機溶劑，如氯仿、低級醇類及其他極性有機溶劑。PAAs在水中和有機溶劑中有一定的固有黏度，其在溶液中和同分子量的乙烯類聚合物相比有更大的流體體積，溶液中聚合物鏈的伸展程度更大。PAAs載體的降解速率受氨基和酰胺鍵數目以及空間結構的影響。鑒于此類聚合物存在上述降解特性，在進行加成聚合的過程中應注意：在聚合反應完成之前，水性介質的存在會使聚合物的分子量增加，聚合反應完成時分子量達到最大，之后水性介質的存在會使聚合物分子量下降，即加成聚合反應和酰胺鍵的水解反應存在競爭關系。

2.2 PAAs基因載體的結構修飾 線形PAAs包括多種具有交替酰胺基團和叔胺基團的聚合物，可通過伯胺基團的兩個活性反應位點或兩個仲胺基團的活性位點與雙丙烯酰胺衍生物通過加成聚合反應制得。主鏈中的叔胺基團可以質子化，進而賦予PAAs堿性和聚合物表面的核正電及良好的水溶性。Lin等[5]合成并研究了含有不同比例仲胺和叔胺基團的PAAs，并進一步將這些氨基單體同含有二硫鍵的交聯劑進行加成聚合，發現此類S2-PAAs具有更高的轉染效率及更低的細胞毒性。Jones等[6]研究了多種線形PAAs的電荷密度、剛性對其與外源目的基因片段結合能力、結合后的穩定性、轉染效率等性質的影響，結果表明，電荷密度、結構柔韌性是通過影響聚合物與核酸的結合能力及復合物膠體穩定性，來進一步影響轉染效率。

在PAAs載體中引入含有二硫鍵的交聯劑引起了基因載體研究領域的廣泛關注，因為二硫鍵可被細胞內環境中的還原酶類降解而發生斷裂，但是在胞外非還原環境中卻可以穩定存在。Lin等[7]研究發現，含二硫鍵的支化PAAs載體比25 kDa的PEI載體轉染效率更高。他們進一步研究發現，側鏈基團的引入及其緩沖能力的提高能夠顯著提高轉染效率；側鏈仲胺基團的引入和氨基間隔距離的縮小，均能夠提高轉染效率并降低細胞毒性。Li等[8]認為，研究S2-PAAs主鏈中二硫鍵的多少只對基因/載體復合物的解聚敏感性有影響，并不是轉染效率升高的主要因素。此外，Piest等[9]在PAAs載體中引入硼酸片段，發現雖然硼酸片段的引入降低了復合物粒徑，轉染效率有一定程度的提高，但同時也增大了細胞毒性。

2.3 PAAs基因載體的靶向修飾 對于PAAs基因載體的靶向修飾，目前的策略之一是對PEG化的聚合物中PEG鏈末端接上特異性配體，而這種配體能夠通過加強抗體介導的細胞內吞作用，進而增加基因/載體復合物的入胞量，甚至利用配體進行特異性的細胞或組織靶向傳遞。Wood等[10]研究的半乳糖修飾的PEG-PAAs樹枝狀聚合物，在人肝細胞HepG2的體外轉染實驗中表現出了相當高的轉染效率。

Yu等[11]設計并構建了具有多個含有二硫鍵的胍基化聚氨基胺(Gua-SS-PAAs)，與PEI相比表現出更高的轉染效率和更低的細胞毒性。引入Gua-SS-PAAs聚合物中的胍和羧基能導致更好的核定位效應，對增強轉染效率、降低細胞毒性起關鍵作用。Yu等[12]制備了還原敏感性及酸不穩定性的雙功能PAAs，將其用于靶向腫瘤細胞、組織的基因傳遞，獲得了一定的腫瘤組織靶向性和較好的轉染效率。

3 PAEs基因載體

3.1 PAEs基因載體的物理化學性質 PAEs基因載體由于酯鍵容易水解，具有易降解的特性，因此細胞毒性較低。線性PAEs能溶于二氯甲烷、甲醇等有機溶劑，同時還能夠溶于酸性水溶液中。研究發現，線性PAEs在pH值為5的環境中降解較慢，而處于強酸或強堿環境下幾乎不發生降解。與含有叔胺的線性PAEs相比，支鏈PAEs作為基因載體應用存在著諸多優勢：支鏈PAEs水溶性更好；支鏈PAEs中伯胺更多，質子化作用更強，包載效率更高，因此能形成粒徑更小的包裹目的基因片段的納米顆粒。此外，由于伯胺和仲胺基團的存在，支鏈PAEs有更大的pH緩沖能力。在一定范圍內，反應時間越長，支鏈PAEs分子量就越大。支鏈PAEs在生理條件下的降解速度要快于酸性條件下的降解速度，親水性高的支鏈PAEs降解速度更快[13]。同PEI基因載體一樣，PAEs也具有質子海綿效應。

3.2 PAEs基因載體的結構修飾 研究發現，PAEs化學結構的差異能夠導致PAEs和DNA之間親合力的不同。聚合物和目的基因片段之間的親合力提高，有助于增強復合物的穩定性，從而提高細胞攝取率。但是，聚合物跟目的基因片段之間的結合力如果太強，目的基因片段不易從基因載體復合物中釋放出來，反而降低轉染效率。研究表明，當聚合物的鏈長超過一定范圍之后，載體的轉染效率會下降，即同種載體隨著分子量的增加，存在一個最佳的轉染效率。Sunshire等[14]研究了PAEs疏水性和末端修飾基團對siRNA轉染效率的影響，結果顯示，如果PAEs合成過程中丙烯酸酯過量，最后以酯基封端，其轉染效率會遠小于以胺基封端的PAEs；進一步研究顯示，如果采用親水的胺基(如羥基胺)封端，PAEs具有較高的轉染效率，如果采用疏水的胺基(如烷基胺、芳基胺)封端，PAEs的轉染效率相對較低。

3.3 PAEs基因載體的靶向修飾 PAEs的靶向修飾包括被動靶向和主動靶向修飾兩方面。被動靶向效應主要受兩個因素影響，即載體表面電荷和基因載體復合物粒徑。對于非特異靶向性細胞攝取，復合物表面正電荷密度越大，與細胞膜表面負電荷作用越強烈，從而越容易被轉運入細胞內[15]。復合物粒徑越小，細胞攝取效率越高，100 nm左右的復合物細胞攝取效率達到最佳狀態。但是，當載體進行體外轉染時，粒徑大的基因/載體復合物可以更好地在培養基中沉淀，有助于提高體外轉染效率；而對于體內基因轉運過程而言，較大的復合物粒徑更容易被巨噬細胞吞噬，無法到達作用靶點。因此，粒徑對載體被動靶向的影響是多方面的，要結合表面電荷和粒徑等因素綜合考慮。

相對于被動靶向修飾，主動靶向的修飾策略更加多樣化、具體化。Zugates等[16]以2-(硫代吡啶)乙胺為單體胺合成聚氨基酯，這樣聚氨基酯側鏈中的硫代吡啶就可以與巰基化的RGD蛋白等配體結合，使其具有靶向性。但是隨著配體取代率的提高，轉染效率反而下降，主要原因與配體的引入改變了聚合物的空間結構有關。隨后Green等[17]放棄共價修飾的方法，轉而將荷負電的蛋白質配體通過靜電結合方式覆蓋在載體表面，形成粒徑100～200 nm的電中性基因載體復合物。結果表明，電中性的復合物在循環系統中與血漿組分的相互作用降低，穩定性提高，體內轉染效率也較非特異性PAEs載體顯著提高。

4 天然生物相容性高分子載體材料

4.1 殼聚糖 殼聚糖作為一種天然陽離子聚合物，通過與帶負電的核酸分子以靜電吸引方式相互作用，使殼聚糖-核酸體系形成包載復合物降低機體內環境中的各種因素對目的基因片段的降解，最終進入細胞。殼聚糖具有細胞毒性低、可生物降解、免疫原性低等特性，體現了良好的生物相容性，且具有抗菌、抗氧化活性及黏附特性等特點。但是殼聚糖的溶解性和靶向性較差，導致其轉染率較低。

Liu等[18]將PEI通過酰胺化反應接枝到羧甲基殼聚糖的主鏈上，這種結構修飾提高了羧甲基殼聚糖與目的基因片段結合形成納米結構復合物的效力,使其具有更高的轉染效率和更低的細胞毒性。Peng等[19]采用甘露糖修飾的殼聚糖包載促胃液素釋放肽基因質粒制備得到的納米顆粒傳遞系統，該系統在小鼠體內顯示出較高的轉染效率，顯著提高了目的基因到達巨噬細胞細胞核的數量。

4.2 葡聚糖 葡聚糖是由多個重復葡萄糖單元構成的多糖聚合物，具有良好的生物相容性，是一類良好的載體材料。葡聚糖具有很多易于化學修飾的羥基結構，已經被廣泛應用于基因轉染和基因治療的研究。Tang等[20]開發了葡聚糖-肽雜交系統作為基因治療的載體，該載體能夠誘導產生更多的目的基因表達和更低的細胞毒性。

4.3 環糊精 環糊精是直鏈淀粉在由芽孢桿菌產生的環糊精葡萄糖基轉移酶作用下生成的一系列環狀低聚糖的總稱，通常由6～8個葡萄糖單元通過α-1,4-糖苷鍵相接，對目的基因有很好的保護作用，且可以攜帶目的基因順利跨過細胞膜。環糊精無免疫原性，生物相容性好，但很少獨立作為基因載體材料使用，用PEI修飾環糊精可顯著提高轉染效率[21]。

5 總結與展望

選擇安全、高效的基因載體是基因治療最為關鍵的一步。盡管相當多的載體材料都能實現基因的有效遞送，然而現有材料遞送目的基因的轉染效率很難超過PEI，也遠未達到病毒載體的水平。低分子量和低電荷密度的陽離子聚合物一般細胞毒性也較低，但轉染效率也會降低。對于陽離子聚合物基因載體的改造，可以對其進行結構修飾，主要策略集中在對伯胺、仲胺、叔胺基的修飾；另一方面可以對其進行靶向修飾，例如采用生物活性基團特異性配體來修飾基因載體。基因載體的仿生與智能設計也是未來增強基因治療效果的有效策略之一，比如可以根據腫瘤組織的不同微環境，如低氧狀態、低pH、高濃度的蛋白酶和氧化還原條件來設計和構建智能載體的尺寸和性質。此外，讓載體同時遞送兩種或多種治療基因的組合方法可以增強癌癥等多基因相關疾病的治療效果并降低體內細胞毒性。