SDF-1對靜脈移植骨髓基質干細胞歸巢作用的影響

張立霞，林青，宋冉冉，王希提

(1濟南市口腔醫院，濟南250014；2濟南市槐蔭區疾病預防控制中心)

牙髓再生的目的是以新生的牙髓組織來替換因炎癥或外傷所累及的炎性牙髓，利用組織工程技術實現牙髓再生是目前牙髓病治療的主要研究方向。研究顯示，通過內源性細胞的歸巢可能實現類牙髓樣及類牙髓-牙本質復合體樣新生組織的再生[1]。近年來，細胞歸巢已替代細胞移植成為牙髓再生研究的新熱點。干細胞歸巢是指靶器官受損后，其周圍組織產生特定的微環境，該微環境誘導干細胞從細胞龕中移出，在某些特異趨化因子的作用下，遷移至受損區域，進行細胞分化從而產生治療作用的過程。骨髓基質干細胞(BMSCs)目前已廣泛用于牙周軟硬組織缺損、頜骨缺損修復等口腔組織的再生修復研究中[2～4]。基質細胞衍生因子1(SDF-1)對干細胞具有強趨化作用，可與干細胞表面的特異性受體CXCR4結合形成偶聯分子對，調控細胞的黏附、運動、分泌、增殖等生物學行為[5]。2016年3月～2017年3月，我們利用攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的慢病毒對BMSCs進行標記，通過GFP的示蹤作用，觀察移植的BMSCs的歸巢能力，評估趨化因子SDF-1對移植BMSCs的歸巢是否存在增強作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與細胞 雄性BALB/c小鼠30只，5～7周齡，體質量(22±1.2)g，由山東大學醫學部實驗動物中心提供。小鼠基質ST2細胞由山東大學遺傳研究所提供。

1.1.2 試劑與儀器 α-MEM培養液(Hyclone公司，美國)，胰蛋白酶(Gibco公司，美國)，胎牛血清(Hyclone公司，美國)，二甲基亞砜(Sigma公司，美國);CD34、CD44、CD45(BioLegend，美國)，CD29(eBioscience，美國)，攜帶GFP的慢病毒載體(上海吉凱基因化學技術有限公司)，DAB顯色試劑盒(北京中杉試劑公司)，DAPI染色液(北京博奧森生物技術公司)，抗熒光衰減封片劑(索萊寶公司)，北京鼠尾膠原蛋白Ⅰ(Gibco，美國)，SDF-1(SantaCru，美國)，倒置熒光顯微鏡及數碼成像系統(OLYMPUS，日本)。

1.2 方法

1.2.1 牙根收集 收集2016年3月～2016年7月濟南市口腔醫院因正畸拔除的單根管下頜第一前磨牙30顆。用快速金鋼砂鉆沿牙齒冠根聯合處將牙根截斷后，根管預備至40#根管銼(破壞根尖封閉，擴大根尖孔至直徑1 mm)。使用75%乙醇清洗牙根，刮除殘留的牙周膜和根尖組織。加入10% NaOCl浸泡1周。加入EDTA，PBS洗滌。將牙根置于含有青霉素和鏈霉素各100 μg/mL的PBS中，4 ℃保存。

1.2.2 牙根分組與SDF-1導入 分別制備2 mg/mL的中性鼠尾膠原蛋白液(3 mg/mL鼠尾膠原蛋白670 μL+三蒸水213 μL+1 mol/L氫氧化鈉17 μL+ 10×PBS 100 μL)及含有100 ng/mL SDF-1的2 mg/mL的中性鼠尾膠原蛋白液(3 mg/mL鼠尾膠原蛋白670 μL+三蒸水213 μL+0.1 μg/μL SDF-1 1 μL+1 mol/L氫氧化鈉17 μL+ 10×PBS 100 μL)。將牙根隨機分為兩份各15個，分別導入上述兩種膠原蛋白液，整個過程在低溫下操作。置于37 ℃培養箱孵育1 h以成膠。

1.2.3 BMSCs的鑒定與轉染標記 取ST2細胞進行復蘇并穩定傳代，取生長狀態良好的細胞，行流式細胞儀檢測，以CD29、CD34、CD44、CD45四個表面分子對細胞進行聯合鑒定。鑒定結果顯示，檢測細胞表達CD29(99.8%)、CD44(98.5%)，此為BMSCs的陽性表面標志物；不表達CD34(0.4%)、CD45(1.0%)，此為造血細胞系的表面標志物，BMSCs的陰性表面標志物。證實該細胞為BMSCs。將細胞置于6孔板中孵育24 h。加入攜帶GFP的慢病毒載體的懸液，作用8 h后，用完全培養基替換病毒液，并使用G418進一步純化，獲取純度較高的GFP+的BMSCs細胞。該示蹤細胞生長狀態良好，細胞形態未見明顯變化，細胞傳代后GFP仍然表達穩定。

1.2.4 動物分組與BMSCs移植 將小鼠隨機分成SDF-1組和對照組各15只。制備GFP+的BMSCs細胞懸液，密度為1×104/μL。鼠尾靜脈注射器固定小鼠，將100 μL細胞懸液緩慢注入小鼠尾靜脈。

1.2.5 牙根植入與標本獲取 BMSCs移植后向小鼠腹膜下注射水合氯醛麻醉。用75%乙醇消毒背部皮膚，縱向切口，暴露皮下組織，形成皮下囊袋。將牙根置于皮下囊袋內，SDF-1組牙根根管內為含有100 ng/mL SDF-1的膠原支架，對照組牙根根管內為空白膠原支架，嚴密縫合。術后腹腔注射青霉素2 d。牙根植入3周后，采用斷頸法處死小鼠。立即取出牙根，浸入4%多聚甲醛溶液，4 ℃固定24 h。沖洗標本，加入10% EDTA脫鈣液中脫鈣3～4個月，隔日更換脫鈣液，待標本針可輕松且無阻力穿過標本時終止脫鈣。

1.2.6 根管內組織學觀察 將牙根沿近、遠、中方向連續切5 μm厚切片，每隔5張挑出切片進行HE染色。每個牙根標本選取3張HE切片，正置光學顯微鏡下調至視野100倍進行觀察并拍照。應用ProgRes CapturePro圖像分析軟件測量根管內新生組織內的血管面積，以視野內新生血管面積與整個視野面積的比值計算新生血管率。

1.2.7 BMSCs歸巢細胞數目檢測 倒置熒光顯微鏡下檢測GFP+BMSCs。牙根沿近、遠、中方向連續切5 μm厚切片，每隔5張挑出切片進行4′，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。每個牙根標本選取3張染色切片，倒置熒光顯微鏡下進行觀察并拍照。拍照前將選取的視野固定，然后分別用藍光和綠光激發，各拍攝圖片1張。為減小誤差并統一計數標準，對細胞分布呈團狀者，計數為2；位于視野邊緣的細胞只左側計數，右側不計。使用Image J2x軟件進行圖像分析，以視野中的GFP+細胞數與視野面積的比值(即單位面積的細胞數)計算歸巢細胞數。每張切片隨機選取5個視野，計算平均值。

2 結果

2.1 兩組根管內組織再生情況比較 兩組根管內均出現新生組織，有細胞和新生血管形成。光學顯微鏡下，對照組可見少量細胞和少量新生血管，以及部分殘余呈網格狀排列的膠原纖維；SDF-1組可見數目較多的細胞以及新生血管，膠原支架基本消失。SDF-1組和對照組的新生血管率分別為5.48%±1.02%、1.58%±0.40%，對照組較SDF-1組降低(P<0.05)。

2.2 兩組歸巢細胞數目比較 倒置熒光顯微鏡下，兩組根管內的新生組織中均可觀測到GFP+細胞，細胞多呈成纖維細胞樣，胞質呈綠色，胞核呈藍色。SDF-1組歸巢細胞數為(5 777±426)個，對照組為(1 812±145)個，對照組較SDF-1組減少(P<0.05)。

3 討論

研究發現，BMSCs在體外培養時具有較強的增殖能力，而在體內時基本長時間處于安定狀態；但在特定的信號刺激下，其增殖與分化潛能可以被激活[6]。BMSCs的分化潛能強大，可分化為內皮細胞、成纖維細胞、脂肪細胞、成骨細胞等。GFP是從水母中分離獲得的示蹤蛋白，它可以通過不同的載體將GFP基因與目的基因整合，整合后的宿主細胞可穩定表達GFP。倒置熒光顯微鏡下，用特定的光線(藍色波長范圍)激發宿主細胞會呈現綠色熒光。本實驗采用攜帶GFP的慢病毒載體系統成功轉染BMSCs細胞。轉染及抗性篩選后的GFP+細胞形態未見明顯變化，生長狀態良好、GFP穩定表達，成為良好的示蹤細胞。

組織工程強調的三要素包括干細胞、三維支架和生長因子。本實驗結果顯示，SDF-1組和對照組的牙根根管內均有新生組織出現，且倒置熒光顯微鏡下均可見GFP+細胞，表明通過小鼠尾靜脈移植GFP+的BMSCs可以歸巢至根管內，提示系統性的移植可能會對牙髓再生產生某種程度上的促進作用。有研究證實，通過靜脈移植的BMSCs可以參與歸巢，歸巢至骨缺損處分化為成骨細胞并參與骨缺損的再生與修復[7，8]。目前臨床應用靜脈移植間充質干細胞來獲取牙髓再生還不現實，但充分應用干細胞歸巢原理在牙髓再生研究中具備一定的合理性，因此無論是局部的還是系統的促進干細胞歸巢，都是促進牙髓再生的重要策略。

SDF-1作為干細胞遷移及歸巢的主要趨化因子，由骨髓基質細胞和其他相關的間皮、上皮細胞等分泌，具有強趨化性[9]。它可以與干細胞表面的特異性受體CXCR4結合形成偶聯分子對，繼而通過偶聯分子對的作用對細胞的黏附、運動、分泌、增殖等生物學行為進行一系列調控。Wu等[10]報道，應用外源性SDF-1可促進移植脂肪干細胞的動員與歸巢，促進其向大鼠的背部創傷區遷移，進而促進背部創傷的愈合。Du等[11]報道，SDF-1可募集牙周膜干細胞歸巢至牙周受損區域，從而促進牙周組織的再生。Cao等[12]建立大鼠下頜骨牽張成骨模型，發現經尾靜脈移植的GFP示蹤的BMSCs可以歸巢至牽張區域，遷移的BMSCs細胞數目與局部應用的SDF-1濃度呈正相關。還有文獻指出，骨髓間充質干細胞的動員及歸巢(無論是外源性移植的還是內源性的)多依賴于SDF-1的調控[13]。

研究顯示，SDF-1在濃度為100 ng/mL時可以顯著提高牙髓干細胞、牙齦干細胞等干細胞的遷移能力，且隨著SDF-1濃度的提高，干細胞的遷移能力并沒有明顯的變化，而是進入一個平臺期[14，15]。本實驗使用的SDF-1濃度亦為100 ng/mL。實驗結果顯示，雖然SDF-1組和對照組都出現了GFP+的BMSCs歸巢，但SDF-1組歸巢的陽性細胞數目顯著多于對照組，證實了趨化蛋白SDF-1對BMSCs具有較強的調控及趨化作用，能顯著提高BMSCs的歸巢能力。因此利用SDF-1促進干細胞歸巢，有可能成為促進牙髓再生的重要策略之一。