miR-16-5p、IRAK2基因?qū)﹃P(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖、凋亡的影響及其機制

于云祥，龔泰芳，劉小濤,柯文,李彬彬

(湖北省十堰市太和醫(yī)院，湖北十堰442000)

骨關(guān)節(jié)炎是一種高發(fā)于老年人群的退行性病變，以軟骨完整性破壞為主要病理特征[1]。骨關(guān)節(jié)炎主要體現(xiàn)在軟骨細胞及細胞外基質(zhì)減少，其中軟骨細胞參與細胞外基質(zhì)的合成，軟骨細胞減少可引起細胞外基質(zhì)減少。研究[2～4]表明,微小RNA(miRNA)可作為骨關(guān)節(jié)炎等多種疾病的治療靶點。因此，探尋miRNA與軟骨細胞減少或凋亡的相關(guān)性對治療骨關(guān)節(jié)炎具有重要意義。研究[5]表明，miR-16-5p對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的肺癌A549細胞損傷具有保護作用，其機制可能與下調(diào)CXCR3的表達有關(guān)。但關(guān)于miR-16-5p對LPS誘導(dǎo)的軟骨細胞增殖及凋亡的影響尚未見相關(guān)報道。研究[6]表明，miR-497a-5p可通過靶向白細胞介素1受體相關(guān)激酶2(IRAK2)減輕LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷。IRAK2屬于IRAK家族成員，可正向調(diào)控細胞內(nèi)炎癥反應(yīng)[7]。但miR-16-5p是否可通過調(diào)控IRAK2基因表達而參與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生過程尚未見報道。2017年12月～2018年12月，本研究采用LPS作為誘導(dǎo)劑構(gòu)建胎鼠軟骨細胞炎癥反應(yīng)模型，觀察miR-16-5p、IRAK2基因?qū)﹃P(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖凋亡的影響，并探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 胎鼠軟骨細胞獲取、質(zhì)粒及試劑 10只雄性胎鼠(C57BL/6J)購自廣東省醫(yī)學(xué)院實驗動物中心(動物合格證號：44007200069715)，無菌條件下剪取胎鼠膝關(guān)節(jié)，0.25%胰蛋白酶消化15 min，無菌PBS洗滌2次，每次3 min，加入0.2%Ⅱ型膠原酶，采用免疫熒光法鑒定軟骨細胞。取軟骨細胞，放入37 ℃、5%CO2的恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，4 ℃下1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基制備單細胞懸液，以3×105/mL的密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，放入37 ℃、5%CO2恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)進行傳代培養(yǎng)。miR-16-5p模擬物(miR-16-5p mimics)及對照模擬物(miR-con)、IRAK2 siRNA(si-IRAK2)及其對照siRNA(si-con)、IRAK2過表達質(zhì)粒(pcDNA-IRAK2)及其對照質(zhì)粒(pcDNA-con)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，Lipofectamine 2000及其相關(guān)轉(zhuǎn)染試劑均購自美國Invitrogen公司。兔抗鼠細胞周期蛋白1(CyclinD1)抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，兔抗鼠B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、B淋巴細胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bax)購自美國CST公司。

1.2 miR-16-5p靶基因預(yù)測驗證 通過靶基因預(yù)測網(wǎng)站starBase預(yù)測miR-16-5p靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-16-5p與IRAK2基因的3′UTR存在結(jié)合位點。采用熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-16-5p的靶基因：利用基因突變技術(shù)將IRAK2基因的3′UTR結(jié)合位點進行突變，分別載入熒光素酶報告基因載體，構(gòu)建野生型報告質(zhì)粒WT-IRAK2與突變型報告質(zhì)粒MUT-IRAK2，分別與miR-16-5p mimics、miR-con共轉(zhuǎn)染至胎鼠軟骨細胞，雙熒光素酶報告基因檢測儀測定軟骨細胞中熒光素酶活性。

1.3 胎鼠軟骨細胞分組 將軟骨細胞分成8組。①取對數(shù)生長期軟骨細胞，分為LPS組、NC組，LPS組細胞加入終濃度為1 μg/mL的LPS 1 mL繼續(xù)培養(yǎng)24 h[8]，NC組細胞加入1 mL培養(yǎng)基。②取對數(shù)生長期軟骨細胞，待細胞融合率達到60%時，更換為Opti-MEM減血清培養(yǎng)基，使用Lipofectamine 2000試劑分別轉(zhuǎn)染miR-16-5p mimics、miR-con、si-IRAK2、si-con，轉(zhuǎn)染6 h后更換為含有10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集轉(zhuǎn)染成功后的軟骨細胞，用1 μg/mL的LPS處理細胞24 h，分別記為LPS+miR-16-5p組、LPS+miR-con組、LPS+si-IRAK2組、LPS+si-con組。③取對數(shù)生長期軟骨細胞，待細胞融合率達到60%時，更換為Opti-MEM減血清培養(yǎng)基，使用Lipofectamine 2000試劑轉(zhuǎn)染miR-16-5p mimics后分成兩組，分別轉(zhuǎn)染pcDNA-IRAK2、pcDNA-con，轉(zhuǎn)染6 h后更換為含有10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集轉(zhuǎn)染成功后的軟骨細胞，用1 μg/mL的LPS處理細胞24 h，分別記為LPS+miR-16-5p+pcDNA-IRAK2組、LPS+miR-16-5p+pcDNA-con組。

1.4 NC組、LPS組細胞中miR-16-5p、IRAK2 mRNA檢測 采用qRT-PCR法。根據(jù)TRIzol試劑盒說明書逐步提取軟骨細胞RNA，待離心管晾干后加入RNase-free水溶解RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為37 ℃ 60 min、95 ℃ 5 min，反應(yīng)結(jié)束后得到cDNA。以cDNA為模板，以U6、β-actin為內(nèi)參，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，循環(huán)40次。引物序列如下：miR-16-5p正向引物為5′-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3′，反向引物為5′-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′；U6正向引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；IRAK2 正向引物為5′-AGTACTTCCACATCTGCCCC-3′，反向引物為5′-CACCTCCCTGAGCTTCTTGA-3′；β-actin正向引物為5′-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3′，反向引物為5′-TGATGTCACGCACGATTT-3′。以2-ΔΔCt表示細胞中miR-16-5p、IRAK2 mRNA的相對表達量。

1.5 各組細胞增殖能力觀察 采用MTT法。取5×104個/mL的各組細胞100 μL，接種于96孔板，每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，充分混勻，室溫孵育10 min，設(shè)置空白孔為空白組，酶標儀檢測各孔在490 nm處的吸光度(OD)值，計算各組細胞存活率。細胞存活率=(各組OD值-空白組OD值)/(NC組OD值-空白組OD值)×100%。以細胞存活率表示細胞增殖能力。

1.6 各組細胞凋亡率測算 取5×104個/mL的各組細胞100 μL，PBS洗滌，胰蛋白酶消化，10 000 r/min離心5 min，收集細胞，PBS洗滌，加入1 mL結(jié)合緩沖液重懸，先后加入5 μL Annexin V-FITC和PI，室溫避光孵育20 min，采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=(早期凋亡細胞數(shù)+晚期凋亡細胞數(shù))/細胞總數(shù)×100%。

1.7 各組細胞中IRAK2、CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白檢測 采用Western Blotting法。取3×105個/mL的各組細胞100 μL，細胞裂解液提取蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫條件下用5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入各蛋白一抗(稀釋比為1∶1 000)，再加入相對應(yīng)二抗(稀釋比為1∶5 000)，室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，滴加ECL顯影，應(yīng)用Image J軟件分析目的蛋白條帶灰度值。以目的蛋白灰度值表示蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 miR-16-5p靶基因驗證結(jié)果 轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-IRAK2、miR-16-5p mimics的軟骨細胞熒光素酶活性為0.26±0.05，轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-IRAK2、miR-con的軟骨細胞熒光素酶活性為1.00±0.10，兩者相比，P<0.05；轉(zhuǎn)染MUT-IRAK2、miR-16-5p mimics的軟骨細胞的熒光素酶活性為1.02±0.10，轉(zhuǎn)染MUT-IRAK2、miR-con的軟骨細胞熒光素酶活性為1.00±0.11，兩者相比，P>0.05。上述結(jié)果表明miR-16-5p靶向結(jié)合IRAK2基因并可負向調(diào)控IRAK2的表達活性。

2.2 LPS、NC組細胞中miR-16-5p、IRAK2 mRNA相對表達量比較 LPS組細胞中miR-16-5p、IRAK2 mRNA的相對表達量分別為1.00±0.10、4.01±0.41，NC組細胞中miR-16-5p、IRAK2 mRNA的相對表達量分別為5.33±0.53、0.85±0.09，兩組相比，P均<0.05，說明LPS誘導(dǎo)的軟骨細胞中miR-16-5p、IRAK2 mRNA相對表達量發(fā)生變化。

2.3 各組細胞增殖能力比較 LPS組、NC組細胞存活率分別為63.03%±6.31%、100.00%±10.26%，兩組相比，P<0.05。LPS+miR-16-5p組、LPS+miR-con組細胞存活率分別為93.16%±9.32%、65.46%±6.53%，兩組相比，P<0.05。LPS+si-IRAK2組、LPS+si-con組細胞存活率分別為91.46%±9.15%、60.45%±6.05%，兩組相比，P<0.05。LPS+miR-16-5p+pcDNA-IRAK2組、LPS+miR-16-5p+pcDNA-con組細胞存活率分別為68.08%±6.81%、93.16%±9.31%，兩組相比，P<0.05。

2.4 各組細胞凋亡率比較 LPS組、NC組細胞凋亡率分別為28.46%±2.85%、1.59%±0.16%，兩組相比，P<0.05。LPS+miR-16-5p組、LPS+miR-con組細胞凋亡率分別為5.09%±0.51%、30.01%±3.02%，兩組相比，P<0.05。LPS+si-IRAK2組、LPS+si-con組細胞凋亡率分別為4.88%±0.50%、29.10%±2.91%，兩組相比，P<0.05。LPS+miR-16-5p+pcDNA-IRAK2組、LPS+miR-16-5p+pcDNA-con組細胞凋亡率分別為20.89%±2.10%、6.15%±0.62%，兩組相比，P<0.05。

2.5 各組細胞中IRAK2、CyclinD1、Bax、Bcl-2、p-NF-κB p65蛋白相對表達量比較 LPS組細胞中IRAK2、CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白相對表達量分別為1.20±0.12、0.40±0.04、0.90±0.09、0.25±0.03，NC組細胞中IRAK2、CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白相對表達量分別為0.35±0.05、1.00±0.10、0.10±0.02、0.85±0.09，兩組相比，P均<0.05。LPS+miR-16-5p組細胞中IRAK2、CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白相對表達量分別為0.90±0.09、0.28±0.03、0.75±0.08、0.10±0.02，LPS+miR-con組細胞中IRAK2、CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白相對表達量分別為0.42±0.05、0.92±0.09、0.30±0.05、0.88±0.08，兩組相比，P均<0.05。LPS+si-IRAK2組細胞中IRAK2、CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白相對表達量分別為0.55±0.06、0.92±0.09、0.30±0.03、0.80±0.08，LPS+si-con組細胞中IRAK2、CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白相對表達量分別為1.20±0.12、0.42±0.05、0.90±0.09、0.32±0.05，兩組相比，P均<0.05。LPS+miR-16-5p+pcDNA-IRAK2組細胞中IRAK2、CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白相對表達量分別為1.10±0.10、0.55±0.05、0.80±0.08、0.42±0.05，LPS+miR-16-5p+pcDNA-con組細胞中IRAK2、CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白相對表達量分別為0.52±0.05、0.92±0.09、0.32±0.05、0.84±0.05，兩組相比，P均<0.05。

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病率逐年增加，探究骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制對研發(fā)治療藥物具有重要現(xiàn)實意義。研究[9]表明，骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生與miRNA表達異常密切相關(guān)，尋找軟骨細胞氧化損傷相關(guān)新型miRNA分子及其內(nèi)在作用機制有助于提高骨關(guān)節(jié)炎防治效果。既往研究[10]采用LPS誘導(dǎo)軟骨細胞損傷模型，并用于驗證研發(fā)藥物對骨關(guān)節(jié)炎的治療效果。本研究采用LPS誘導(dǎo)軟骨細胞制備細胞損傷模型，探討miRNA在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖及凋亡過程中的作用機制。

研究[11]顯示，miR-16-5p異常表達與胰島素抵抗、糖尿病、高血壓等疾病密切相關(guān)。研究[12]表明，miR-16-5p表達降低可通過上調(diào)血管生成因子表達進而參與血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移過程導(dǎo)致微循環(huán)功能障礙。本研究結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的軟骨細胞中miR-16-5p表達降低、細胞存活率降低、細胞凋亡率增加，與文獻[13]報道結(jié)果相似，提示LPS可促進軟骨細胞凋亡，可能與下調(diào)miR-16-5p表達有關(guān)。進一步研究顯示，上調(diào)miR-16-5p表達的軟骨細胞存活率升高、細胞凋亡率降低，通過檢測細胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-16-5p表達后軟骨細胞中CyclinD1、Bcl-2蛋白表達升高，而Bax蛋白表達降低。研究[14]指出，通過提高CyclinD1表達可正向調(diào)控軟骨細胞周期進程，促進細胞增殖。軟骨細胞凋亡在骨關(guān)節(jié)炎致病機制中扮演重要角色，細胞凋亡與Bcl-2、Bax蛋白表達密切相關(guān)，軟骨細胞中Bcl-2表達降低可加速細胞凋亡，Bax表達降低可減少軟骨細胞凋亡。結(jié)合本研究結(jié)果，說明上調(diào)miR-16-5p表達可促使Bax表達降低，促使CyclinD1、Bcl-2蛋白表達增高，減少軟骨細胞凋亡，促進細胞增殖，從而提高骨關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)功能。

研究[15]發(fā)現(xiàn)，IRAK2表達水平升高可促進炎癥細胞因子表達，而參與機體內(nèi)炎癥反應(yīng)發(fā)生過程。IRAK2α-螺旋結(jié)構(gòu)域的小分子模擬物可干擾IRAK2和IRAK4之間的相互作用，破壞MyD88與IRAK4、IRAK2形成復(fù)合物，從而減輕哮喘等炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的軟骨細胞中IRAK2表達升高，抑制IRAK2表達可抑制軟骨細胞凋亡、促進細胞存活，與相關(guān)文獻報道相似，提示IRAK2表達升高可能是促進骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的重要機制。本研究通過雙熒光素酶報告實驗結(jié)果證明，IRAK2是miR-16-5p的靶基因，miR-16-5p可負向調(diào)控下游靶基因IRAK2表達。進一步研究顯示，上調(diào)IRAK2表達聯(lián)合上調(diào)miR-16-5p表達處理后，細胞存活率顯著降低、細胞凋亡率顯著升高，CyclinD1、Bcl-2蛋白表達水平降低、Bax蛋白表達水平升高，說明IRAK2高表達可逆轉(zhuǎn)miR-16-5p對軟骨細胞增殖及凋亡調(diào)控的作用。分析其原因，可能是IRAK2通過調(diào)控細胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達而發(fā)揮作用。

綜上所述，LPS誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中miR-16-5p低表達、IRAK2高表達，上調(diào)miR-16-5p表達、下調(diào)IRAK2基因表達均可促進軟骨細胞增殖、抑制細胞凋亡，其作用機制可能與CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白表達有關(guān)。