細粒棘球蚴病的研究進展

米吉提·莫合他爾汗

（新疆維吾爾自治區動物衛生監督所，新疆烏魯 木齊 830063）

囊型包蟲病（Cystic echinococcosis），是由隸屬于帶科（Taeniidae）棘球屬（Echinococcus）的細粒棘球絳蟲（Echinococcus gramsloses）的中絳期蟲引起的一類人獸共患寄生蟲病，該病呈世界性分布，嚴重危害公共衛生[1]。細粒棘球蚴主要寄生于人、野生和家養的有蹄類動物（中間宿主）的器官組織中，以肝臟最為常見，其次是肺部，并形成包囊[2]。

主要流行于牧區，不僅嚴重威脅牧民的生命健康，還給當地畜牧業的發展帶來了巨大經濟損失，該病的流行受生物、社會、環境等因素的影響，具有地方流行性，是一個重要的公共衛生問題。我國已經將 棘球蚴病列入2012～2020年的《國家中長期動物疫病防治規劃》中，作為重點防范和優先防治的動物疫病。目前，在我國33個省/自治區當中，已有20多個地區發布了感染病例的報道。

1 生活史

棘球絳蟲必須依賴兩種哺乳動物宿主才能完成其生活史。經過蟲卵，棘球蚴和成蟲三個階段。成蟲寄生于犬科動物和貓科動物的小腸內，孕節片或蟲卵隨糞便排出；細粒棘球絳蟲的蟲卵由有蹄動物中間宿主食入蟲卵，從而發育成棘球蚴，隨后 棘球蚴在肝、肺和其他臟器中發育生長，直到棘球蚴被終宿主吞食后在其小腸內發育為成蟲。人感染棘球蚴后可在肝、肺等器官形成占位性病灶。

2 中間宿主

細粒棘球絳蟲主要在家畜中循環，其中間宿主主要為有蹄類家畜（例如綿羊、牛、豬、山羊、馬、駱駝）。

3 終末宿主

狗、狼、狐、豺等為終末宿主。

4 包蟲病的檢測技術

包蟲病是我國西部地區農牧民因病致貧和因病返貧的主要疾病之一，同時也是影響畜牧業發展的重要疾病。包蟲病的中間宿主（包括人、牛、羊等）對人類的包蟲病的免疫應答研究較多，但大多涉及臨床癥狀表現后開展的研究。對于患者的背景及感染劑量方面的研究報道較少，大多數包蟲病手術患者在術后往往有繼發性感染的可能。同時，一般包蟲病患者在進行診治時，都已經是患病的后期，在感染初期，患者很難被確診。目前，通常以影像學和免疫學診斷技術相結合進行包蟲病的確診。也有很多分子生物學技術可用于包蟲病診斷。

對中間宿主開展免疫診斷時，可用囊液、粗提原頭節蛋自為包被抗原進行酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測，粗提原頭節蛋自的敏感性和特異性較高。抗原B （AgB）是由細粒棘球蚴病病原性幼蟲產生的高豐度蛋白，是由原頭節和包囊合成和分泌的。E.gAgB具有很好的免疫原性，能夠識別出80%包蟲病患者，在調節宿主免疫應答反應中具有很重要的作用。E.g AgB家族在E.g差異表達的5個發育階段中至少含有10個單一基因。對兩個國家采集到的病理材料進行分析，結果表明每一個基因在E.g幼蟲和成蟲階段是完全相同的。將其DNA序列與Genbank上的基因進行比較，發現它們在五g發育過程中是高度保守區，但是E.g AgB具有明顯的變異和多態性。同時差異PCR結果顯示，這些基因在E.g生活史的不同階段的表達存在差異，只有E.gAgB3在所有生活階段都表達。

包蟲病的檢測技術抑制差減雜交（suppressionsubtractive hybridization，SSH）是一種高效鑒定和分離克隆差異表達基因的新技術。該技術以高效、便捷和假陽性率低等優勢受到廣大研究人員的重視，在分子生物學研究領域得到了廣泛的應用。目前，該技術在寄生蟲學研究中的應用不是很多，主要應用在尋找與寄生蟲不同發育階段相關的差異表達基因和與寄生蟲抗藥性相關的差異表達基因以及其他相關基因的研究，如與不同蟲株、不同宿主或性別差異相關的基因。在細粒棘球絳蟲發育過程中，可通過此技術得到不同發育期差異表達的基因，并將這些基因用于診斷和防治包蟲病。

實時熒光定量PCR （real-time PCR）是指在PCR反應體系中加人熒光基團，利用熒光信號累計監測整個PCR過程，最后通過特定數學原理對未知模板進行定量分析的方法。其熒光檢出方法可分為熒光嵌合法和熒光探針法兩大類。熒光嵌合法通常使用SYBRGreen I，它是一種能夠與所有dsDNA雙螺旋小溝區域結合的具有綠色激發波長的染料，它與PCR合成的雙鏈DNA結合，在激發光照射下產生熒光，通過熒光強度的監測，可以實時檢測PCR擴增的產物量。熒光探針法通常使用水解探針Taqman探針，它是兩端標記了熒光基團的寡核昔酸探針，末端為淬滅基團，末端為熒光基團。當完整的探針與目標序列配對時，熒光基團發射的熒光因與端的淬滅基團接近而被淬滅，也稱為熒光共振能量轉移（fluorescence reso-nance energy transfer，FRET），當進行延伸反應時，聚合酶的外切酶活性可切除探針，使得熒光基團與淬滅基團分離。常用的熒光基團有FAM，V1C和NED等，淬滅基團有TAMRA，DAB CYL和BHQ等。Realtime PCR是一種準確、快速的核酸定量分析方法，也是定量研究基因表達水平最為有效的方法之一，這將為包蟲病特異基因篩選提供有利的技術支撐。

5 單克隆抗體

動物脾臟有上百萬種不同的B淋巴細胞系，選擇性表達出不同基因的B淋巴細胞合成不同的抗體。當機體受抗原刺激時，抗原分子上的許多決定簇分別激活各個表達不同基因的B細胞。被激活的B細胞分裂增殖形成效應B細胞（漿細胞）和記憶B細胞，大量的漿細胞克隆合成和分泌大量的抗體分子分布到血液、體液中。如果能選出一個制造一種專一抗體的漿細胞進行培養，就可得到由單細胞經分裂增殖而形成細胞群，即單克隆。單克隆細胞將合成針對一種抗原決定簇的抗體，稱為單克隆抗體。

6 單克隆抗體的基本原理

要制備單克隆抗體需先獲得能合成專一性抗體的單克隆B淋巴細胞，但這種B淋巴細胞不能在體外生長。而實驗發現骨髓瘤細胞可在體外生長繁殖，應用細胞雜交技術使骨髓瘤細胞與免疫的淋巴細胞二者合二為一，得到雜種的骨髓瘤細胞。這種雜種細胞繼承兩種親代細胞的特性，它既具有B淋巴細胞合成專一抗體的特性，也有骨髓瘤細胞能在體外培養增殖永存的特性，用這種來源于單個融合細胞培養增殖的細胞群，可制備抗一種抗原決定簇的特異單克隆抗體。

7 單克隆抗體診斷的運用

利用成蟲抗原免疫動物以獲抗體國內僅見多克隆抗體，有的用成蟲多克隆抗體建立糞抗原檢測方法。國外已有檢測犬糞中成蟲的商品試劑盒，其中有使用單克隆抗體的也有使用多克隆抗體的。但是多克隆抗體批次與批次問的特異性與親和力不同，抗原抗體容易形成格了結構（沉淀反應），特異性低。單克隆抗體則特異性識別單一抗原決定簇，特異性高，抗體均一。用單克隆抗體建立的檢測方法具有上述的優點，有著多克隆抗體無法相比的優勢，本研究利用雜交瘤技術建立了1株能持續穩定分泌抗包蟲成蟲單克隆抗體的雜交瘤細胞株。

細粒棘球絳蟲成蟲蟲體抗原與原頭節蟲體抗原之問存在著很高的交義反應，不同的組分主要在成蟲有孕節及內含的蟲卵，表明這兩采用Th1類細胞因了IFN-γ，IL-2等的編碼基因作為基因佐劑與保護性蛋白編碼基因串聯裝入含有CMV強啟動了質粒pcDNA。

總之，從我國對家畜包蟲病防控工作已取得的成果表明，只要阻斷細粒棘球絳蟲循環鏈中終末宿主家/牧犬排泄蟲卵（傳染源），便可控制包蟲病的傳播。即通過實施“犬犬投藥，月月驅蟲”控制模式，就可使新疆包蟲病在很短時間內由高發控制到低水平。