外周血循環腫瘤細胞監測在乳腺癌術后轉移早期診斷中的應用

華紅，郝貴亮，王清玲，於晶，解童玲，姚魯璐

(1青島市海慈醫療集團，山東青島266033；2青島市婦女兒童醫院)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，我國每年有近7萬人死于此疾病[1,2]。研究表明，30%～40%的早期乳腺癌患者會發展為轉移性乳腺癌(MBC)，死亡風險極高[3,4]。目前，臨床上除了影像學診斷外，血清標志物中使用最普遍的檢測指標是糖類抗原15-3(CA15-3)和癌胚抗原(CEA)，但此指標特異性差、靈敏度不高[5,6]。因此，尋找創傷小、靈敏度高的血清分子標志物，對乳腺癌患者術后轉移的早期診斷具有重要意義。循環腫瘤細胞(CTC)是利用現代技術，在腫瘤患者血液中檢測到的一種微轉移細胞。它是實體瘤或轉移灶中的腫瘤細胞進入外周血循環，在循環中腫瘤細胞相互聚集形成的微小癌栓，是乳腺癌遠處轉移復發的重要環節[7]。我們猜測，乳腺癌患者術后血液中出現CTC的時間要早于臨床確診轉移的時間。因此，我們對96例乳腺癌患者術前至術后3年內外周血CTC的變化進行了監測，并記錄其術后臨床轉移情況，探討監測外周血CTC對臨床早期發現乳腺癌術后轉移的意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年8月～2014年8月我院收治的乳腺癌患者96例作為乳腺癌組，均為女性，年齡25～73歲、中位年齡46.5歲，右側54例、左側42例。經免疫組織化學分型：Luminal A型42例、Luminal B型33例、HER-2過表達型16例、三陰性型乳腺癌5例。納入標準：患者病理組織切片證實原發性病灶為浸潤性乳腺癌；均行乳腺癌改良根治術治療；術前均行乳腺超聲及鉬靶檢查；術前、術后按本研究隨訪時間進行CTC監測及全身CT、MRI掃描；發現的轉移灶經病理組織學確診。排除標準：非原發性病灶；非經過改良根治術治療；有嚴重的并發癥。將同期在我院確診的乳腺纖維瘤患者30例作為對照組。患者均簽署知情同意書，本研究經醫院倫理委員會同意批準。

1.2 主要試劑和儀器 CK8/18鼠抗人單克隆抗體(美國CST公司)；人淋巴細胞分離液(天津灝洋生物公司)；流式細胞儀(美國Beckman公司)；低溫超速離心機(德國Eppendorf公司)。

1.3 外周血CTC監測方法

1.3.1 監測時間 乳腺癌組患者于術前24 h內、術后每隔3個月定期監測外周血CTC，截止時間為術后檢測出CTC陽性，如未檢測出陽性則隨訪至術后3年。記錄術前24 h內CTC陽性例數及術后檢測到CTC陽性的時間。

1.3.2 外周血CTC檢測方法

1.3.2.1 標本收集 用真空ACD抗凝管抽取乳腺癌組患者術前24 h內及術后各隨訪時間(見1.4)獲得的肘靜脈血10 mL，以及對照組肘靜脈血10 mL，立即輕柔充分混勻抗凝管8次，防止血塊形成，室溫存放，在24 h之內行外周血CTC檢測。

1.3.2.2 富集CTC 采用密度梯度離心法。首先準確吸取7.5 mL人淋巴細胞分離液于干凈的試管內，取患者7.5 mL全血與等量的Hank′s液混勻，離心后取環狀乳白色單個核細胞層，向其中加入5 mL Hank′s液，再次離心后，吸取試管底部細胞沉積，重復一次后吸取試管底部細胞。

1.3.2.3 CTC檢測 采用流式細胞術(FCM)。以CK8/18陽性細胞為CTC待測細胞，向其中先加入500 μL預冷(4 ℃)固定液，室溫下孵育離心后棄上清加入1.5 mL破膜劑，充分混勻后室溫下孵育離心后加入2 mL PBS液，混勻后分成兩管，一管為試驗管，一管為陰性對照管。將試驗管加入CK8/18鼠抗人單克隆抗體5 μL，低速混勻，室溫孵育后加入PBS液2 mL，離心后棄去上清液。試驗管和對照管分別加入熒光二抗5 mL，低速混勻，5 min后棄去上清液，再加入1%多聚甲醛0.5 mL，低速混勻后放置4 ℃冰箱避光保存，備上機檢測。

1.3.2.4 CTC陽性評價標準 以7.5 mL外周血單核細胞中CK8/18陽性細胞數來表示外周血 CTC含量，當外周血CTC≥5個/7.5 mL時判定為陽性。

1.4 術后腫瘤轉移情況隨訪 對乳腺癌組患者于術后的第3個月起隨訪至術后3年，每隔3個月行全身CT及MRI掃描；如發現外周血CTC呈陽性，則調整為每隔1個月進行全身CT及MRI掃描。發現影像學轉移后，經病理組織學檢查確診臨床轉移，記錄術后腫瘤轉移例數及部位。

1.5 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。臨床資料的描述采用百分比，頻數資料組間的比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組CTC檢測結果

2.1.1 術前及對照組CTC檢測結果 術前患者CTC總陽性率為43.7%(42/96)，其中Luminal A型、Luminal B型、HER-2過表達型、三陰性型患者的CTC陽性率分別為33.3%(14/42)、51.5%(17/33)、56.3%(9/16)、40.0%(2/5)；對照組陽性率為0(0/30)。術前患者CTC總陽性率高于對照組(P<0.01)，各病理分型CTC陽性率均高于對照組(P均<0.01)，不同病理分型的乳腺癌患者CTC陽性率差異均無統計學意義(P均>0.05)。

2.1.2 乳腺癌組患者術后CTC監測結果 術后第3個月時，患者外周血CTC均為陰性。隨訪至3年時，CTC陽性患者為31例。

2.2 術后腫瘤臨床轉移情況 隨訪3年期間，經病理組織學確診發生臨床轉移42例，其中腋窩淋巴結轉移11例、肺胸膜轉移13例、顱腦轉移6例、肝轉移5例、骨轉移7例。

2.3 術后發生臨床轉移患者的CTC陽性率情況 術后3年內，42例發生腫瘤轉移患者的外周血CTC總陽性率為73.8%(31/42)，其中腋窩淋巴結轉移、肺胸膜轉移、顱腦轉移、肝臟轉移、骨轉移患者的CTC陽性率分別為81.8%(9/11)、69.2%(9/13)、66.7%(4/6)、100%(5/5)、57.1%(4/7)。各部位轉移患者間的CTC陽性率差異無統計學意義(P均>0.05)。

2.4 術后出現CTC陽性至臨床確診轉移時間的分析 31例CTC陽性患者中，術后出現CTC陽性至臨床確診轉移的時間，最短為檢測到CTC陽性后第12周、最長為第44周，其中檢測到CTC陽性后第12周發現1例、第16周發現6例、第20周發現9例、第24周發現7例、第28周發現4例、第32周發現2例、第36周發現1例、第44周發現1例，在檢測到CTC陽性后第16～28周有26例CTC陽性患者發生轉移，占83.8%，是臨床確診乳腺癌轉移的高峰時段。

3 討論

乳腺癌是一種高度異質性腫瘤，其基因異質性決定了其復雜的生物學行為和臨床病理特點。研究表明，30%～40%的早期乳腺癌患者即使接受了手術治療，仍會發展為MBC，而MBC患者死亡風險極高，治療以緩解臨床癥狀、改善生活質量及提高生存率為主。因此，越早發現乳腺癌術后轉移，可以更及時有效地選擇合適的治療方案，大大提高患者的生活質量及存活率。但是，目前MBC常用的血清學標志物靈敏性和特異性均較低，不能滿足臨床需求。

CTC是利用現代免疫學和分子分析技術，在患者血液中能檢測到的一種微轉移細胞，它是實體瘤或轉移灶中的腫瘤細胞進入外周血循環，在循環中腫瘤細胞通過遷移、黏附、相互聚集形成的微小癌栓，是乳腺癌遠處轉移復發的重要環節。與淋巴骨髓相比，外周血標本具有易獲得、創傷小且可以反復采集，患者依從性較強，是臨床上常規檢測CTC較為理想的標本來源。隨著現代化檢測技術檢測設備的不斷發展進步，CTC檢測方法的敏感性和特異性將不斷提高。本研究發現，術前患者CTC總陽性率高于對照組，表明乳腺癌患者術前外周血CTC陽性明顯增高。

作為一種全身性疾病，在早期就有腫瘤細胞擴散到全身[8]。盡管早期根治性手術和手術后放化療已大大提高了乳腺癌患者的生存期，但仍有大部分患者死于乳腺癌的遠處轉移。1989年，Ashworth等[9]發現癌癥患者血液中存在CTC，認為在乳腺癌早期即有CTC進入血液循環并發生全身播散[10,11]。CTC的出現是腫瘤患者不良結果的一個獨立預示指標[12,13]。2007版美國臨床腫瘤學會乳腺癌生物學標記物臨床應用指南就將CTC列為新的腫瘤標志物[14]。Budd等[15]比較了CTC與傳統影像學檢測評估治療結果的預測價值，發現影像學緩解且持續高水平者與影像學緩解且CTC低水平者相比，中位總生存期(OS)顯著降低，而影像學進展且CTC低水平者其OS明顯比影像學進展且CTC高水平者長，認為外周血CTC含量的變化對于MBC的診斷和預后評估較影像學檢測更敏感。因此，動態監測CTC變化，有利于及時了解患者病情，并且可為其制定個體化綜合治療方案提供依據。本研究發現，術后第3個月時，患者血清中CTC均為陰性，CT及MRI均未發現轉移灶；之后則檢測出CTC陽性患者31例，確診臨床轉移患者42例，分析從術后檢測到CTC陽性到臨床病理組織學確診的時間，最短為檢測到CTC陽性后第12周、最長為第44周，表明外周血CTC比影像學檢查至少可以提前12周預測到乳腺癌轉移；其中檢測到CTC陽性后的第16～28周，83.8%的患者被確診發生臨床轉移，表明術后檢測到CTC陽性后的第16～28周是臨床確診乳腺癌轉移的高峰時段。

綜上所述，乳腺癌患者具有較高的外周血CTC陽性率，行改良型根治術后CTC的再次出現是遠處轉移病灶形成的表現；乳腺癌外周血CTC檢測陽性時間明顯早于臨床確診時間，可以更早地預測MBC發生，對患者的診治和評價預后具有重要的臨床意義。因此乳腺癌患者外周血CTC監測在乳腺癌患者術后轉移的預測方面有著良好的應用前景。