變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）技術在分析動物腸道菌群多樣性中的應用

李峪鵬，許禎瑩，李娟，蘇志鵬，劉瀚揚，朱佳文*

（1.四川農業大學動物醫學院，四川 成都 611130；2.四川省成都市農林科學院，四川 成都 611130；3.四川特驅投資集團有限公司，四川 成都 610207）

近年來，有很多關于動物腸道微生物菌群組成與其自身健康息息相關的報道。研究者們利用下一代測序工具（NGS）對腸道微生物菌群的組成進行快速且精確的研究。16S rRNA分析技術是最常用來分析微生物多樣性的工具，它可以利用相關區域的變異性對菌群組成的差異性進行分析。變性凝膠梯度電泳（PCR-DGGE）技術在16S rRNA技術的基礎上進一步對微生物多樣性進行分析，其原理是利用相同大小DNA片段不同的堿基序列，讓DNA片段通過由低到高的變性梯度凝膠進行電泳，當DNA分子遷移到不同變性濃度的聚丙烯酰胺凝膠時，不同序列的DNA片段會停留在不同濃度的凝膠位置。

1 PCR-DGGE技術的優缺點

PCR-DGGE技術具有快速高效檢測突變DNA片段的優點，并且重復性好，目前已在畜牧行業中廣泛應用。在使用DGGE工具時，需要提取樣品的總DNA，并設計帶有CG的夾板引物，對DNA的可變區域（V1、V1-V3、V3、V4-V5、V3-V5、V6-V8a、V6-V8b、V8）進行PCR擴增，通過DGGE指紋圖譜進行特異性分析，建立系統發育樹，最終得到微生物菌群的差異性。雖然PCRDGGE技術比16S rRNA和ERIC-PCR略為復雜，但精確度更高、重復性更好。有學者分別利用ERIC-PCR和PCR-DGGE技術對喂服枯草芽孢桿菌的肉雞腸道菌群進行研究，結果得出：雖然兩種方法檢測結果均顯示飼喂枯草芽孢桿菌能提高肉雞腸道微生物的豐度和種群密度[1]，但從指紋圖譜和統計條帶數量上來看，PCR-DGGE技術優于ERIC-PCR技術[2]。然而PCR-DGGE技術仍然有著局限性：在DNA的保存與提取時，若方法不當則會造成DNA降解，引起實驗誤差；在研究復雜生態環境系統時，往往會有種類復雜的微生物組成，DGGE圖譜只有其中的優勢菌群才會呈現出條帶，而含量低于1%以下的弱勢菌群不會被檢出；并且該方法依賴于基因數據庫，如果數據庫中序列信息不夠則也會受到限制。

2 PCR-DGGE技術的具體分析方法

2.1 糞便樣品保存 糞便樣品的保存方法直接影響DNA降解程度，而分子生物學分析的可信度依賴于DNA模板的降解程度。目前可靠的糞便保存方法包括低溫保存[3]、福爾馬林保存、硅珠保存、DETs保存、干燥保存、乙醇保存等[4]。在需要長時間保存DNA時，一般選擇乙醇保存法，可以在數月到數年內保存較高質量的DNA樣本，而在較短時間內保存DNA，使用低溫保存法即有不錯的效果[5]。

2.2 樣品中的DNA提取 采用市場上成熟的DNA提取試劑盒對動物糞便樣品中的DNA進行提取。提取到的DNA使用細菌16S rRNA基因通用引物27F和1492R對糞便樣品總DNA進行第一輪PCR擴增，擴增產物經過一定比例稀釋作為模板，再用特異性引物（例如針對細菌16S rRNA基因V3區域的特異片段進行GC引物設計）進行巢氏PCR擴增，擴增產物用于后續DGGE分析。

2.3 電泳分析 在變性劑梯度為40%～60%，電壓60 V和60 ℃條件下電泳14 h后，用相應的核酸染料染色并用Quantity One等軟件進行DGGE圖譜聚類分析。計算每個樣品中微生物的多樣性指數：豐度（S）、指數（H）和均勻度（E）。S為豐度，即每一條泳道的條帶數目，H和E的計算公式為：H＝∑PilnPi，Pi＝Ni∕N，Ni表示樣品上第i個條帶的吸收峰面積，N表示樣品中所有條帶吸收峰的總面積；E＝H∕lnS。從DGGE凝膠中選取明顯或優勢條帶進行割膠回收，并進行測序分析。測得的序列與NCBI數據庫進行比對，用MEGA等軟件對序列進行配比分析和系統發育樹構建。

3 PCR-DGGE技術在分析動物腸道微生物多樣性中的應用

3.1 動物腸道菌群多樣性分析的重要性 動物腸道中棲息著的大量微生物在消化吸收、能量代謝、免疫調節、抗病能力等方面發揮著重要作用，正常情況下腸道菌群處于一個平衡狀態，對以上生理功能起著保護、促進作用，但是當菌群的數量、種類、比例等各方面失調時就會引起疾病，嚴重的會引起動物死亡[6]。研究動物腸道菌群多樣性，通過分析動物腸道菌群的豐度以及結構組成，進一步了解動物各種疾病病因、生長發育速度與腸道微生物之間的關系，從而為預防和治療腸道疾病提供合理的理論依據。目前已有微生態制劑開始應用于預防和治療疾病，提高動物生產性能等方面[7-8]。

3.2 應用案例 Suchodolski等[9]分別從犬只十二指腸、空腸、回腸、結腸和直腸中收集腸道內容物，通過PCR-DGGE技術評價了犬腸道內不同區域和不同犬只間細菌菌群的差異，通過計算Simpson多樣性指數、Shannon-Weaver多樣性指數和均勻度來評價細菌的多樣性，結果表明，不同犬只腸道菌群的優勢微生物不同，存在明顯的差異性。Lubbs等[10]利用PCR-DGGE技術檢測成年貓日常蛋白質攝入量對胃腸道菌群變化的影響，發現高蛋白會引起微生物種群的急劇變化，在雙歧桿菌數量減少的高蛋白飲食中可以通過益生菌進行調節。脫氧雪烯醇是一種霉菌毒素（DON），是很多國家面臨的食品安全問題，有學者通過PCR-DGGE技術利用常規微生物選擇策略，從雞腸道中分離出了脫氧雪蘭素轉化菌，大大提高了細菌選擇的效率。因此，采用PCR-DGGE技術引導腸道細菌轉化是一種高效的方法[11]。

Liu等[12]用PCR-DGGE和克隆文庫方法分別分析了中國對蝦腸道微生物的多樣性，得到了相似的結果，主要以弧菌為主，證明了兩種不同的分子生物技術在一定程度上具有代表性。2016年，馮方周等[13]采用PCR-DGGE技術研究雛雞大腸桿菌感染模型，發現隨著雛雞日齡增加，其腸道菌群多樣性也逐漸增加，腸球菌、大腸桿菌、葡萄球菌以及梭菌均有出現，在感染大腸桿菌后，圖譜條帶出現增加或缺失的現象，而噬菌體作用后的有些條帶日漸恢復正常。由于養鴨業的快速發展，大部分鴨群排泄物直接進入到人類賴以生存的生活環境中，因此有學者利用PCR-DGGE技術分析鴨場水樣樣本中的細菌群落結構，客觀地反映鴨場環境微生物多樣性的特點，為防治細菌性疾病提供理論依據[14]。

為了研究獺兔腹瀉后盲腸菌群結構的變化情況，周毅等[15]應用PCR-DGGE和Real-Time PCR分析健康獺兔與腹瀉獺兔盲腸菌落的差異性，發現獺兔腹瀉后盲腸有益微生物數量降低，有害微生物數量增加，但是菌群結構差異不明顯。2018年，為研究海參花酶解物對小鼠腸道微生物的影響，有學者采用PCR-DGGE技術分析其微生物群落結構及動態變化，發現對照組樣品中擬桿菌門、變性菌門為小鼠腸道的優勢菌群，隨著海參花酶解物濃度的增加，小鼠腸道菌群中的幽門螺旋桿菌屬含量降低，厚壁菌門乳酸桿菌屬含量增加，說明海參花酶解物對調節小鼠腸道菌群有一定的作用[16]。

4 小結

研究動物腸道菌群是研究動物營養水平的基礎，是現代畜牧業抗生素替代策略必不可少的途徑。腸道微生物多樣性受宿主環境變化的影響非常大，PCR-DGGE技術可以在16S rRNA技術基礎上進一步對微生物多樣性進行分析，并具有一定的優勢，在追蹤腸道微生物菌群結構特征和監測生物種群動態中具有重要的作用，能更好地為人類了解和監測動物腸道微生物穩態提供幫助。