沉默VEGF對人鼻咽癌放射抗拒細胞株CNE-2R侵襲遷移的影響

陳莉 林國享 陳凱華 孫永楚 萬芳竹 朱小東，

鼻咽癌是我國高發的惡性腫瘤之一，放療是主要的治療手段［1-2］。而抗輻射是患者復發、轉移及治療失敗的主要原因［3］。因此，探討抗輻射鼻咽癌細胞遷移和侵襲機制有重要意義。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是常見的促血管內皮細胞生長因子，可誘導血管形成，增加血管通透性，影響腫瘤微環境中免疫細胞的功能［4］。VEGF還能促進癌細胞DNA過度復制，誘導放射抗性基因合成，從而產生放射抵抗［5］。研究發現VEGF在多種惡性腫瘤組織，包括鼻咽癌組織中呈高表達，可能參與腫瘤遠處轉移，且與不良預后有關［6-10］。本研究通過構建VEGF沉默表達的鼻咽癌放射抗拒細胞株，探討VEGF對細胞侵襲和遷移能力的影響，以期尋找鼻咽癌放射抗拒靶點，為闡明鼻咽癌轉移機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人鼻咽癌放射抗拒細胞株CNE-2R由廣西醫科大學附屬腫瘤醫院實驗研究部構建并保存。GV248慢病毒質粒骨架（hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin）、293T 細胞、大腸桿菌菌株 DH5α、慢病毒包裝輔助質粒pHelper 1.0載體、pHelper 2.0載體和嘌呤霉素均購自上海吉凱基因技術有限公司；GAPDH引物購自上海生工生物工程技術有限公司；VEGF引物由日本Takara公司設計并合成；鼠抗人VEGF-A抗體購自美國NOVUS公司；兔抗人GAPDH抗體購自美國CST公司；山羊抗兔二抗、抗鼠二抗購自上海碧云天技術有限公司。Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，凝膠成像分析儀購自美國Bio-Rad公司，熒光定量PCR儀購自德國Analytik Jena公司。

1.2 重組慢病毒表達質粒及慢病毒構建

在GenBank中搜索人VEGF核苷酸序列（編號：NM_001171626），設計3個干擾VEGF的靶點序列（LV1、LV2和LV3）和1條無關序列（NC）。根據各靶序列分別設計并合成shRNA的單鏈DNA Oligo（內含AgeⅠ和EcoRⅠ酶切位點），構建重組慢病毒表達質粒GV248-LV1、GV248-LV2、GV248-LV3 和 GV248-NC，進行雙酶切鑒定和測序驗證。293T細胞置于37℃、5%CO2條件下培養24 h，融合度達70%～80%時將上述4種重組慢病毒表達質粒、pHelper 1.0載體質粒、pHelper 2.0載體質粒與Lipofectamine 2000轉染試劑混合培養48 h，離心后獲得重組慢病毒原液VEGF-LV1、VEGF-LV2、VEGF-LV3 和 VEGF-NC，分裝并于-80℃下保存。

1.3 病毒滴度測定

293T細胞接種于96孔板（4×103/孔）培養24 h后，分別將 10 μL、1 μL 和 0.1 μL的慢病毒原液 VEGF-LV1、VEGF-LV2、VEGF-LV3和VEGF-NC與完全培養基混合成100 μL轉染液。選取所需的293T細胞孔，加入病毒轉染液培養4 d，用倒置熒光顯微鏡觀察熒光表達情況，計算重組慢病毒滴度，以及當MOI=20時所需的轉染病毒體積，進行下一步慢病毒轉染。重組慢病毒滴度=熒光細胞數/病毒原液量。MOI=病毒滴度×病毒體積/細胞數目。

1.4 構建穩定轉染VEGF的CNE-2R細胞系

CNE-2R細胞接種于含10%胎牛血清+100 U/mL青霉素+100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640完全培養基，用胰酶消化并傳代培養。取對數生長期的CNE-2R細胞接種于24孔板（2.5×104/孔）；培養 24 h后，分別轉染 1.250 μL VEGF-LV1、1.111 μL VEGF-LV2、1.429 μL VEGF-LV3和1.111 μL VEGF-NC；用嘌呤霉素篩選轉染后細胞，獲得穩定傳代的轉染細胞系，分別記為CNE-LV1組、CNE-LV2組、CNE-LV3組和CNE-NC組，同時設CNE-2R細胞為空白對照組。在倒置熒光顯微鏡（×200）下觀察各組細胞熒光表達情況并計算轉染效率。轉染效率=（熒光細胞數/總細胞數）×100%。

1.5 RT-qPCR檢測VEGF mRNA的表達

收集以上各組細胞，按照Trizol試劑說明書提取細胞總RNA，采用Primer ScriptTMRT試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA。以GAPDH為內參，進行實時熒光定量PCR檢測。引物序列：VEGF-F為5'-TCACAGGTACAGGGATGAGGACAC-3'，VEGF-R 為 5'-CAAAGCACAGCAATGTCCTGAAG-3'；GAPDH-F 為 5'-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3'，GAPDH-R 為 5'-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3'。PCR 反應條件：預變性95 ℃ 30 s，1個循環；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 個循環。采用 2-△△Ct法計算VEGF mRNA的相對表達量。實驗重復3次。

1.6 Western blot檢測VEGF蛋白的表達

采用RIPA蛋白裂解液提取各組細胞總蛋白，根據BCA法進行蛋白定量檢測，取各組蛋白質20 μg，加入適量上樣緩沖液，混勻，凝膠電泳，濕轉法轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入稀釋的一抗［VEGF（1∶1 000）和 GAPDH（1∶1 000）］，4 ℃下搖床孵育過夜，洗膜后加入稀釋的二抗（1∶1 000），室溫孵育1 h后洗膜。采用ECL化學發光法曝光，凝膠成像系統拍照分析并檢測各條帶灰度值。實驗重復3次。

1.7 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

收集處于對數生長期的各組細胞，經胰酶消化重懸后，按4×105/孔接種于6孔板中。待細胞融合度約為80%時，用200μL移液器槍頭在孔板上作劃痕標記，用完全培養基連續培養48 h。顯微鏡觀察0 h、48 h細胞劃痕愈合情況。實驗重復3次。

1.8 Transwell小室檢測細胞遷移和侵襲能力

用不含血清的培養基將各組細胞重懸成3×105/mL的細胞懸液，并分別接種于含Matrigel基質膠和不含Matrigel基質膠的24孔板Transwell小室上室中，200μL/孔。下室中加入600μL完全培養基，并于37℃、5%CO2條件下培養48 h。用棉簽擦去上室中的細胞，PBS清洗，4%多聚甲醛固定40 min，姬姆薩染液染色45 min，再用 PBS清洗，晾干，在倒置顯微鏡（×200）下觀察并拍照，計數5個視野的細胞數。實驗重復3次。

1.9 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行數據分析。計量數據以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，若組間差異有統計學意義，進一步的兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 重組慢病毒表達質粒雙酶切鑒定和測序驗證結果

重組慢病毒表達質粒雙酶切鑒定結果顯示，環狀質粒被切斷后呈線性條帶改變，說明雙酶切位點正確，見圖1。經測序進一步鑒定，GV248-LV1組、GV248-LV2組和GV248-LV3組相應的干擾shRNA序列成功連接到載體中，表明重組質粒構建成功，見圖2。

圖1 GV248-VEGF質粒的酶切電泳圖Fig.1 Enzymatic digestion electrophoresis of GV248-VEGF plasmid

圖2 GV248-VEGF插入序列的測序峰Fig.2 Sequencing peak of insertion sequence of GV248-VEGF

2.2 重組慢病毒的滴度

倒置熒光顯微鏡觀察結果顯示，轉染慢病毒的4組細胞熒光強度隨著病毒原液體積的增加而增強，見圖3。當病毒原液量為 0.1 μL時，VEGF-LV1組、VEGF-LV2組、VEGF-LV3組和VEGF-NC組的熒光細胞數分別為 8×104個、9×104個、7×104個和 9×104個；慢病毒的滴度分別為 8×108TU/mL、9×108TU/mL、7×108TU/mL、9×108TU/mL；當 MOI=20 時，慢病毒轉染實驗所需病毒原液體積分別為1.250 μL、1.111 μL、1.429 μL、1.111 μL。

圖3 不同體積重組慢病毒對293T細胞的轉染效果（×200）Fig.3 Transfection effect of different volumes of recombinant lentivirus on 293T cells（×200）

2.3 構建穩定沉默VEGF的CNE-2R細胞

倒置熒光顯微鏡觀察結果顯示，4種慢病毒分別轉染CNE-2R細胞后均帶有綠色熒光，轉染效率＞90%（圖4），說明轉染成功。RT-qPCR檢測（圖 5A）和 Western blot檢測（圖5B）結果顯示，空白對照組、CNE-NC組、CNE-LV1組、CNE-LV2組和CNE-LV3組的VEGF mRNA和蛋白表達量差異均有統計學意義（F=4.129，P＜0.001；F=571.194，P=0.031），其中 CNE-LV3組VEGF的mRNA和蛋白表達量均低于其余4組（P＜0.05）。以上結果表明，CNE-LV3組細胞沉默VEGF效果最佳，以其進行后續實驗。

2.4 沉默VEGF對CNE-2R細胞遷移能力的影響

劃痕實驗結果顯示，空白對照組、CNE-NC組、CNE-LV3組的細胞遷移率分別為（50.17±1.76）%、（50.63±1.52）%、（37.97±1.56）%，組間差異有統計學意義（F=59.292，P＜0.001）；與空白對照組和 CNE-NC組相比，CNE-LV3組細胞遷移率均下降（t=8.989，P＝0.001；t=10.070，P=0.001），但空白對照組與 CNE-NC組差異無統計學意義（t=0.348，P＝0.746），見圖 6A。

Transwell小室遷移實驗結果顯示，空白對照組、CNE-NC組、CNE-LV3組的穿膜細胞數分別為（95.3±3.8）個、（94.3±4.0）個、（41.3±1.5）個，組間比較差異有統計學意義（F=261.347，P＜0.001）；與空白對照組和CNE-NC組相比，CNE-LV3組穿膜細胞數明顯減少（t=22.910，P＜0.001；t=21.305，P＜0.001）；而空白對照組與CNE-NC組比較，差異無統計學意義（t=0.419，P＝0.697），見圖 6B。

圖4 重組慢病毒轉染CNE-2R細胞的效果（×200）Fig.4 Transfection effect of recombinant lentivirus on CNE-2R cells（×200）

圖5 轉染后CNE-2R細胞VEGF mRNA及蛋白的表達情況Fig.5 Expression of VEGF mRNA and protein in CNE-2R cells after transfection

圖6 沉默VEGF對CNE-2R細胞遷移能力的影響Fig.6 Effect of silencing the expression of VEGF on the migration ability of CNE-2R cells

2.5 沉默VEGF對CNE-2R細胞侵襲能力的影響

Transwell小室侵襲實驗結果顯示，空白對照組、CNE-NC組、CNE-LV3組的細胞穿膜數分別為（105.3±1.5）個、（93.3±2.5）個、（46.3±2.1）個，組間差異有統計學意義（F=774.886，P<0.001）。CNE-LV3組細胞穿膜數分別與空白對照組和CNE-NC組比較，差異有統計學意義（t=38.711，P＜0.001；t=30.237，P＜0.001）；而空白對照組與CNE-NC組比較，差異無統計學意義（t=1.877，P＝0.134）。見圖 7。

圖7 沉默VEGF對CNE-2R細胞侵襲能力的影響（×200）Fig.7 Effect of silencing the expression of VEGF on the invasion ability of CNE-2R cells（×200）

3 討論

正常的血管形成受血管生成因子和抗血管生成因子共同調控，當促血管生成因子過度活躍時，可導致血管持續性生長，使腫瘤血管異常形成［11］。VEGF廣泛存在于人體各器官，其表達受多種因素調控。在腫瘤發生發展中，腫瘤細胞能分泌較高水平的VEGF，從而引發腫瘤血管內皮細胞有絲分裂，促進血管形成；同時VEGF還可促進單核細胞、成纖維細胞浸潤，從而形成腫瘤基質并促進腫瘤細胞進入新生血管內，進而增強腫瘤細胞轉移能力［12］。研究發現，VEGF對鼻咽癌預后產生不良影響［13-15］。

本課題組前期研究證實構建的鼻咽癌放射抗拒細胞株CNE-2R較CNE-2細胞具有更高的侵襲遷移能力［16］。RNA干擾技術可特異性沉默特定基因的表達，且具有級聯放大效應和可遺傳性，目前已廣泛應用于探索基因功能、惡性腫瘤治療等。沉默基因表達的RNA干擾載體包括慢病毒、腺病毒、質粒和siRNA化學合成等，其中慢病毒載體可轉染多種類型細胞，具有轉染效率高、可插入的基因片段多、表達穩定等優點［17］。本研究制備3種靶向干擾VEGF基因的慢病毒載體，轉染人鼻咽癌放射抗拒細胞株CNE-2R。鑒于本課題組前期實驗發現MOI=20時慢病毒轉染效果最佳［18］，因此選取MOI=20時轉染所需的病毒體積轉染CNE-2R細胞，結果均成功構建了沉默VEGF的CNE-2R細胞，其中CNE-LV3組VEGF沉默效果最佳，用于后續實驗。VEGF沉默CNE-LV3細胞的成功構建，為進一步探討VEGF對鼻咽癌轉移的影響奠定了實驗基礎。

HE等［19］研究發現，沉默NETO2可降低鼻咽癌CNE-1、HONE-1細胞的侵襲和遷移能力。也有研究表明上調VEGF表達可促進胰腺癌細胞、卵巢癌細胞和肝癌細胞的侵襲和遷移能力［20-22］，而抑制VEGF表達則可減弱黑色素瘤細胞、乳腺癌細胞、肝癌細胞的轉移能力［23-25］。本研究劃痕實驗和Transwell小室實驗結果顯示，CNE-LV3組細胞較空白對照組和CNE-NC組細胞覆蓋劃痕區域的速度慢，細胞遷移率顯著降低；細胞遷移和侵襲的穿膜細胞數亦明顯減少，表明沉默VEGF能抑制鼻咽癌CNE-2R細胞的遷移和侵襲能力。VEGF可能是抑制放射抗拒性鼻咽癌轉移的有效靶點。但目前VEGF導致鼻咽癌轉移的具體作用機制尚未明確，后期將在分子和動物水平進一步探索VEGF對鼻咽癌侵襲遷移能力的影響。

本研究成功構建了沉默VEGF表達的鼻咽癌放射抗拒CNE-2R細胞株，且沉默VEGF能有效抑制細胞遷移和侵襲能力，VEGF可能是抑制放射抗拒性鼻咽癌轉移的有效靶點，以VEGF為靶點的治療方法有望為鼻咽癌治療提供新的思路。