基于生物信息學方法探討Her-2基因表達對胃癌免疫細胞浸潤的影響

張靜 游路寬 胡毅

胃癌是我國常見的消化系統惡性腫瘤，超過2/3的患者確診時已屬晚期，預后不佳［1］。據報道，8%～53%的胃癌與人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，Her-2）蛋白過表達有關［2］。Her-2是由ERBB2基因編碼的ERBB家族受體重要成員之一，可與其他家族成員結合形成異源二聚體，通過激活下游RAS-RAF-MEK-ERK通路或PI3KAKT-mTOR通路向細胞傳遞增殖和存活信號。當細胞Her-2過表達或功能增加時，可向下游傳遞過多細胞增殖信號，從而導致腫瘤形成［3］。此外，Her-2還可激活血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受體VEGFR的啟動子，增加 VEGF和VEGFR蛋白表達與釋放，促進腫瘤細胞浸潤和轉移［4-5］。此外，以往有研究發現Her-2抑制劑可誘導強烈的腫瘤淋巴細胞浸潤，同時依賴免疫調節作用而發揮抗癌作用［6］。近期國內學者發現Her-2或通過抑制cGAS-STING通路抑制腫瘤免疫微環境中的免疫細胞，從而發揮抗腫瘤作用［7］。本研究通過生物信息學方法分析人類癌癥基因組圖譜（the Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫的胃癌相關數據，在基因水平探討Her-2對胃癌免疫微環境免疫細胞浸潤的潛在影響，為后續研究Her-2與胃癌關系奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 數據來源

胃癌數據來源于TCGA。以“Stomach adenocarcinoma”為關鍵詞，從癌癥數據共享（GDC）網站（https：//portal.gdc.cancer.gov/repository）下載407例胃癌患者的RNA-Seq數據，以及臨床信息、預后等資料，其中癌組織樣本375例，癌旁組織樣本32例。排除缺少癌旁組織樣本及臨床資料不全者，最終共納入354例胃癌患者的RNA-Seq數據。同時從GEO數據庫下載30例胃癌樣本轉錄組數據的GSE36968作為驗證數據集。

1.2 腫瘤浸潤免疫細胞評估

CIBERSORT是一種基于轉錄組數據評估腫瘤組織中22種免疫細胞占比的計算方法，通過574個標記基因表達值進行反卷積，從而估算腫瘤組織中不同免疫細胞的比例［8］。本研究采用該算法計算胃癌組織中22種免疫細胞的浸潤占比，并采用R軟件（版本號3.6.0）對354例胃癌樣本進行CIBERSORT分析，每個樣本獲得一個P值，P值＜0.05的樣本納入后續分析。以Her-2 mRNA表達水平的中位數（4.52）為界，將354例樣本分為高表達組和低表達組。

1.3 基于特定基因標識的功能變化分析

基因集變異分析（gene set variation analysis，GSVA）是評估轉錄組基因集富集情況的一種非參數無監督分析方法［9］。GSVA通過對感興趣的基因集合進行綜合打分，將基因水平變化轉變為通路水平變化，進而判斷樣本的生物學功能。本研究從Molecular Signatures Database數據庫（v7.0版）（http：//software.broad-institute.org/gsea/msigdb）下載基因集合，采用GSVA算法對每個基因集合進行綜合打分，評估不同樣本潛在的生物學功能變化。

1.4 統計學方法

采用R 3.6.0軟件進行數據分析。采用秩和檢驗分析Her-2高表達組和Her-2低表達組樣本浸潤免疫細胞占比的差異；Pearson相關分析各種免疫細胞浸潤程度的相關性。基于GSVA方法，采用Pearson相關系數衡量179例胃癌樣本相關基因信號通路表達與Her-2表達的關系。以雙側P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CIBERSORT分析結果

CIBERSORT分析結果顯示，179例胃癌樣本中靜息狀態記憶性CD4+T細胞占比最高（16.5%），隨后占比自高到低依次為CD8+T細胞（11.1%）、幼稚B細胞（10%）、M2型巨噬細胞（8.8%）、M0型巨噬細胞（7.5%）等。見圖1A。

CIBERSORT方法評估兩組免疫細胞浸潤的情況，結果顯示179例（Her-2低表達組104例，高表達組75例）樣本的免疫細胞浸潤程度差異有統計學意義（P<0.05）。104例Her-2低表達組和75例高表達組樣本的CD8+T細胞、靜息狀態記憶性CD4+T細胞、M0型巨噬細胞及肥大細胞浸潤程度差異亦有統計學意義（P=0.029，0.049，0.027，0.008），其中 CD8+T 細胞及肥大細胞在Her-2低表達組中的浸潤程度較高表達組高，而靜息狀態記憶性CD4+T細胞和M0型巨噬細胞在Her-2低表達組中的浸潤程度低于高表達組。見圖1B。

2.2 179例胃癌樣本中免疫細胞浸潤程度的相關性

Pearson相關分析179例胃癌樣本中22種免疫細胞浸潤程度的相關性，結果顯示，CD8+T細胞、靜息狀態記憶性CD4+T細胞、M0型巨噬細胞及肥大細胞等4種存在浸潤差異的免疫細胞浸潤程度具有相關性，其中CD8+T細胞與靜息狀態記憶性CD4+T細胞、M0型巨噬細胞及肥大細胞浸潤程度均呈負相關（r=-0.36，-0.46，-0.33），靜息狀態記憶性 CD4+T 細胞與M0型巨噬細胞及肥大細胞浸潤程度亦均呈負相關（r=-0.05，-0.19），M0型巨噬細胞與肥大細胞浸潤程度呈正相關（r=0.36）。見圖1C。

2.3 GSVA分析結果

通過GSVA方法對179例胃癌樣本進行GO分析（采用GO gene sets基因集對樣本進行打分），結果顯示Her-2基因表達與CD8+T細胞、靜息狀態記憶性CD4+T細胞、M0型巨噬細胞及肥大細胞的發育、誘導分化、遷移調控相關，且影響這4種免疫細胞的浸潤能力和程度，見表1。KEGG分析（采用curated gene sets基因集對樣本進行打分）Her-2基因表達可能影響179例胃癌樣本的潛在代謝通路，發現Her-2基因表達升高與相關腫瘤形成信號有關，見表2。

2.4 GEO數據驗證分析結果

采用CIBERSORT算法分析GEO數據GSE36968中30例胃癌樣本的轉錄組數據，發現Her-2基因表達對腫瘤免疫細胞浸潤的影響與TCGA數據庫分析結果基本一致。見圖2。

表1 采用GSVA進行GO分析的結果Tab.1 Results of GO analysis using GSVA

圖1 TCGA數據的CIBERSORT分析結果Fig.1 Results of CIBERSORT analysis of TCGA data

圖2 GEO數據的CIBERSORT分析結果Fig.2 Results of CIBERSORT analysis of GEO data

表2 采用GSVA進行KEGG分析的結果Tab.2 Results of KEGG analysis using GSVA

3 討論

機體對腫瘤產生的免疫應答是主要以CD8+T細胞為主的免疫細胞浸潤至腫瘤組織并參與腫瘤免疫循環的過程［10-11］。機體早期通過免疫監視功能可對腫瘤進行免疫清除，同樣腫瘤細胞也可通過免疫編輯作用抑制免疫系統甚至可以通過多種機制逃避免疫系統的攻擊［12-13］。隨著全球范圍內有關胃癌Her-2研究數據及抗Her-2靶向治療經驗的積累，人們對Her-2在胃癌診療中的意義也有了更深刻的認識。但既往研究大多集中于報道Her-2與腫瘤細胞生長及細胞凋亡的關系，Her-2與腫瘤免疫循環的研究相對較少。近期，有研究發現Her-2可與STING羧基端尾部結合，同時可利用AKT1特定位置磷酸化抑制TBK1活性，阻止STING與TBK1結合而抑制抗腫瘤免疫活性，腫瘤細胞內的Her-2水平及活性也可能是控制免疫感知能力和相關免疫反應表型的決定性因素［7，14-16］。

本研究通過CIBERSORT方法分析Her-2基因低表達及高表達胃癌樣本中免疫細胞的浸潤情況，發現Her-2基因高表達組靜息狀態記憶性CD4+T細胞及M0型巨噬細胞占比相對Her-2基因低表達組高，而CD8+T細胞及肥大細胞占比較Her-2基因低表達組低。機體免疫應答包含天然免疫應答和適應性免疫應答，需各種細胞及因子參與。與初始T細胞相比，記憶T細胞因其表面分子已發生改變且信號傳遞在細胞內存在差異，再次免疫應答時記憶T細胞可更快、更易激活，從而快速高效介導免疫應答［17］。在本研究中，相對于Her-2基因低表達組，Her-2基因高表達組胃癌組織中靜息狀態記憶性CD4+T細胞較多，而CD8+T細胞在兩組中的占比則相反。該結果表明Her-2高表達的腫瘤組織，其微環境中的記憶性CD4+T細胞未被活化，且CD8+T細胞浸潤程度也明顯低于Her-2低表達的腫瘤組織。進一步通過GSVA分析，發現Her-2表達程度與CD4+T細胞受體結合呈負性相關，這意味著Her-2高表達的腫瘤組織，其微環境內的CD4+T細胞與腫瘤抗原的結合反而降低，從而導致靜息狀態記憶性CD4+T細胞無法活化為效應性T細胞，減少了細胞因子（如IFN-γ及IL-4等）分泌，降低對CD8+T細胞的趨化作用，進而導致CD8+T細胞浸潤程度降低［18］。免疫細胞的浸潤程度相關性分析中，CD8+T細胞與靜息狀態CD4+記憶性T細胞浸潤程度呈負相關亦證實這一結果。

作為有高度可塑性的M0型巨噬細胞，在IFN-γ或細菌脂多糖的誘導下能活化形成M1型巨噬細胞，并釋放多種抗腫瘤細胞活化因子，同時可激活機體特異性免疫應答。M0型巨噬細胞亦可在Th2細胞釋放的IL-4和IL-13等誘導活化形成M2型巨噬細胞，并釋放多種炎癥或免疫抑制分子，從而抑制炎癥反應和促進腫瘤生長和轉移［19］。如前所述，在Her-2基因高表達組中，因為靜息狀態的記憶性CD4+T細胞未能被腫瘤組織抗原“活化”，導致IFN-γ、IL-4及IL-13等細胞因子生成減少，從而抑制M0型巨噬細胞向其他類型巨噬細胞轉化，致使腫瘤微環境中M0型巨噬細胞增高，而減少的細胞因子則降低對CD8+T細胞浸潤的趨化，這一結果在M0型巨噬細胞與CD8+T細胞浸潤程度相關性分析中亦得以印證。結合GSVA的GO分析結果還發現Her-2基因高表達與巨噬細胞集落刺激因子的形成及應答、巨噬細胞因子產生的負性調控以及巨噬細胞遷移的負性調控等生物學途徑均呈不同程度負相關，因此推測Her-2基因高表達可能限制了M0巨噬細胞進一步發育分化。

肥大細胞能分泌多種細胞因子和介質，影響淋巴細胞的特異性反應，參與免疫調節，還參與抗原呈遞［20］。本研究中Her-2基因高表達組的肥大細胞占比較Her-2基因低表達組少，結合GSVA中GO分析結果發現Her-2基因高表達與肥大細胞分化、化學趨化因子及肥大細胞遷移呈負相關。推測可能是Her-2基因高表達導致腫瘤組織釋放的肥大細胞趨化因子減少，從而使Her-2基因高表達的腫瘤組織中肥大細胞浸潤較少。為了驗證TCGA數據庫分析結果，本研究采用GEO收錄的胃癌轉錄組數據進一步驗證Her-2基因表達與胃癌免疫細胞浸潤程度的關系，結果與TCGA數據庫分析結果基本一致。說明Her-2基因高表達一定程度上可抑制胃癌組織中以上抗腫瘤免疫應答的“正面因素”。

本研究通過生物信息學方法分析發現胃癌中Her-2基因高表達可能對免疫系統產生一定抑制作用，進而影響免疫系統發揮抗腫瘤作用，但本研究僅基于生物信息學分析，有關結論仍需通過大樣本臨床研究加以驗證。