恒溫擴增芯片法在下呼吸道感染細菌耐藥基因檢測中的應用

林桂陽 陳愉生 鄭雅卿

[摘要]目的 探討恒溫擴增芯片法在下呼吸道感染細菌耐藥基因檢測中的應用。方法 收集2017年5～10月我院外科重癥監護室103例肺部感染患者的下呼吸道分泌物，進行恒溫擴增芯片法檢測和細菌培養+藥敏試驗，分析患者的耐藥基因檢出情況、細菌培養+藥敏試驗結果、恒溫擴增芯片法與藥敏試驗符合率。結果 恒溫擴增芯片法在90例患者中檢測到13種耐藥基因，陽性檢出率為87.4%（90/103）。103例患者中49例細菌培養陽性，細菌培養陽性率為47.6%，培養得到50株菌株。對培養的50株菌株進行藥敏試驗，顯示氨曲南和環丙沙星等11種抗生素的出現頻率均在20%以上。以細菌培養為金標準，恒溫擴增芯片法與藥敏試驗耐藥藥物種類相符的樣本符合率為65.3%;其中以CTX-M9、OXA-23、MecA、OXA-66、KPC-2和ermB這6個基因符合率最高，且按類別組合分析的結果符合率更佳。結論 恒溫擴增芯片法的檢出率都明顯高于傳統的細菌培養+藥敏試驗，且兩者符合率較高，在臨床上具有良好的應用前景。

[關鍵詞]恒溫擴增芯片;下呼吸道感染;細菌耐藥;環介導恒溫擴增技術

[中圖分類號] R56 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1674-4721（2019）12（c）-0032-05

[Abstract] Objective To investigate the application of constant temperature amplification chip method in the detection of bacteria drug resistance genes of lower respiratory tract infection. Methods The lower respiratory tract secretions of 103 patients with pulmonary infection in the surgical intensive care unit of our hospital from May to October 2017 were collected for constant temperature amplification chip detection and bacterial culture+drug sensitivity test. The results of drug resistance gene detection， bacterial culture and drug sensitivity， consistency rate of constant temperature amplification chip method and drug sensitivity test were analyzed. Results A total of 13 kinds of drug resistance genes were detected in 90 patients by constant temperature amplification chip， and the positive rate was 87.4% （90/103）. Among the 103 patients， 49 were positive in bacterial culture， the positive rate was 47.6%， and 50 strains were obtained. The drug sensitivity test of 50 strains showed that the frequency of antibiotics in Aztreonam and Ciprofloxacin etc were more than 20%. Bacterial culture was used as the gold standard， the coincidence rate of samples with constant temperature amplification chip method and drug sensitivity test drug resistance was 65.3%. Among them， CTX-M9， OXA-23， MecA， OXA-66， KPC-2 and ermB have the highest coincidence rate， and the results by category combination analysis have better coincidence rate. Conclusion The detection rate of the constant temperature amplification chip method is significantly higher than the traditional bacterial culture+drug sensitivity test， and the coincidence rate of the two is high， which has a good application prospect in clinical.

[Key words] Constant temperature amplification chip; Lower respiratory tract infection; Bacterial resistance; Loop-mediated isothermal amplification

目前抗生素的耐藥性已經成為全球醫療界共同面臨的問題，了解致病菌的耐藥性是指導臨床用藥的重要依據[1]。作為金標準的細菌培養和藥敏試驗耗時長，可能使患者錯過最佳的治療時機。近年來，耐藥基因檢測已在科研中推廣，但臨床鮮有應用，主要原因為可檢測的耐藥基因比較單一，難以反映復雜的耐藥表型。因此，需要一種特異性更好，且能同時對多個耐藥基因進行檢測的方法。2000年，日本的Notomi等[2]報道了一種恒溫的核酸擴增方法，即環介導恒溫擴增技術（1oop-mediated isothermal amplification，LAMP），其優點在于特異性強、等溫高效、敏感性高，而且操作簡便，更加適用于臨床。該技術目前已被應用于病毒、細菌、真菌、支原體和寄生蟲等方面的檢測[3-6]，且已應用于臨床醫學檢測[3]。本研究將LAMP與微流體芯片技術結合，設計成恒溫擴增芯片，能同時檢測20個耐藥基因，基本覆蓋了常見感染性疾病尤其是下呼吸道感染常見致病菌的耐藥基因。本研究收集了下呼吸道樣本進行基因芯片檢測，與細菌培養+藥敏試驗對比，旨在探討恒溫擴增芯片法在下呼吸道感染細菌耐藥基因檢測中的應用，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

收集2017年5～10月我院外科重癥監護室103例肺部感染患者的下呼吸道分泌物，其中男76例，女27例;年齡7～97歲，平均（61±18）歲。納入標準[7]：①有咳嗽、咳痰的癥狀和肺部啰音者;②經過胸部CT檢查或床邊X線檢查證實存在肺部感染者;③能使用可控式的負壓集痰管經由氣管插管或氣管切開導管采集下呼吸道分泌物或經支氣管鏡采集患者的下呼吸道分泌物者。排除標準：①病毒性肺炎、肺部真菌感染者;②肺結核患者。

1.2方法

經由可控式負壓集痰管或支氣管鏡采集下呼吸道分泌物標本，每份標本均做兩種處理，一是先提取核酸，后置于恒溫擴增芯片裝置中進行耐藥基因檢測，二是直接送細菌室進行細菌培養+藥敏試驗。

1.2.1恒溫擴增芯片法 ?采集的下呼吸道分泌物經過處理后提取核酸（細菌基因組DNA提取試劑盒，玻璃珠法，北京博奧晶典生物技術有限公司，批號：360090），按照操作說明加樣到芯片中，使用Rtisochip型低速離心恒溫擴增微流控芯片核酸分析儀（北京博奧晶典生物技術有限公司）對已加樣的芯片進行檢測，軟件自動進行數據分析后顯示歸一化曲線、質控和各檢測指標的擴增時間值。檢測結果根據樣本的擴增時間值與參考值對比，小于參考值為陽性，反之為陰性。

1.2.2細菌培養+藥敏實驗 ?采集的下呼吸道分泌物標本2 h內接種于血平板和巧克力平板，35℃恒溫箱孵育24～48 h，使用VITEK-2全自動細菌鑒定藥敏儀（生物梅里埃公司，VITEK-2）或者API鑒定板條對其進行鑒定。藥敏試驗采用VITEK-2全自動的細菌鑒定藥敏儀或K-B法。耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌（Methicillin resistant coagulase-negative staphylococci，MRCNS）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicilin-resistant staphylococcusaureus，MRSA）和超廣譜β內酰胺酶（extended spectrum β-lactamases，ESBLs）菌株均用VITEK-2全自動的細菌鑒定藥敏儀初篩，確證采用美國國家實驗室標準化研究所（CLSI）推薦的確證試驗。藥敏試驗結果則按照培養結果值（藥物產生的抑菌圈直徑）分成敏感、中介和耐藥3個方面。

1.3觀察指標及評價標準

分析患者的耐藥基因檢出情況、細菌培養+藥敏試驗結果、恒溫擴增芯片法與藥敏試驗符合率。

記錄下呼吸道樣本的耐藥基因檢測結果以及細菌培養+藥敏試驗的檢測結果。根據表1中20個耐藥基因與耐藥種類之間的對應關系，將藥敏試驗的耐藥結果與耐藥基因檢測結果結合分析，分為3種情況：①符合，耐藥基因陽性，且藥敏試驗的耐藥結果提示對該耐藥基因所對應的藥物耐藥;②不符合，耐藥基因陽性，但藥敏提示該基因對應的藥物不耐藥;或者反之，藥敏提示某些藥物耐藥，但對應的基因檢測卻呈陰性;③不完全符合，1份樣本測得多個基因，與對應的藥敏試驗耐藥結果符合，部分基因結果不符合。

2結果

2.1恒溫擴增芯片法的耐藥基因和檢出情況

恒溫擴增芯片法在90例患者中檢測到ermB、aadA1、mecA、CTX13-M1、OXA-66、OXA-23、CTX-M9、kpc-2、mefA、aacC1、CMY-2、DHA-1和VIM-2共13種耐藥基因，陽性檢出率為87.4%（90/103），檢出率前5位的基因為ermB、MecA、aadA1、OXA-66和CTX-M1，分別達到70.9%，32.0%，29.1%，21.4%和19.4%（圖1）。

2.2細菌培養+藥敏試驗的檢出情況

在103例患者中49例細菌培養陽性，培養出8種共50株菌株（其中1例檢出兩個菌株），陽性檢出率為47.6%（49/103），檢出的菌株分別為鮑曼不動桿菌（14.28%）、銅綠假單胞菌（11.22%）、肺炎克雷伯菌（10.20%）、大腸埃希菌（6.12%）、金黃色葡萄球菌（6.12%）、流感嗜血桿菌（1.20%）、肺炎鏈球菌（1.20%）和表皮葡萄球菌（1.20%）。進一步對這些檢出菌株進行藥敏試驗，耐藥頻率最高的抗生素依次為：氨曲南、環丙沙星、阿莫西林/棒酸、頭孢吡肟、左氧氟沙星、慶大霉素、亞胺培南、氨芐青霉素、復方新諾明、頭孢唑啉和妥布霉素，以上11種藥物的出現頻率均在20%以上（圖2）。

2.3恒溫擴增芯片法與細菌培養符合率分析

除去細菌培養陰性，沒有藥敏試驗結果的54例樣本無法使用藥敏試驗作為金標準來分析恒溫擴增芯片法的符合率外，共得到49份樣本50個菌株的藥敏試驗結果可與耐藥基因檢測結果分析對比。對比方法分為以下3種情況。

2.3.1按逐個病例分析 ?即根據表1的對照關系，每份樣本作為整體，耐藥基因陽性檢出率與藥敏試驗耐藥藥物種類對比結果是否完全相符，顯示符合的有32例，不符合8例，不完全符合9例。恒溫擴增芯片法與藥敏試驗的整體符合率為65.3%（32/49）。

2.3.2按逐個耐藥基因分析 ?即單獨計算每個檢測到陽性的耐藥基因與同樣本藥敏試驗的耐藥結果符合情況，CTX-M9、OXA-23、MecA、OXA-66、KPC-2、ermB和CTX-M1等耐藥基因的檢測與金標準具有較高的符合率，分別為83.30%（5/6）、81.80%（9/11）、81.25%（13/16）、80.00%（12/15）、80.00%（4/5）、71.40%（5/7）和64.30%（9/14）（圖3）。

2.3.3按基因對應的耐藥類別成組分析 ?即按照耐藥基因的類別分組后按組分析檢測陽性的耐藥基因是否與藥敏試驗耐藥結果相符，顯示測得同一類耐藥基因個數越多，符合率越高。OXA-23、OXA-66、KPC-2組合和CTX-M1、CTX-M9組合的符合率均可達到100%（表2）。

3討論

恒溫擴增芯片法可同步檢測20種耐藥基因，高效且快速（僅需1 h）。效率和速度明顯高于細菌培養+藥敏試驗。其檢測結果與作為金標準的細菌培養+藥敏試驗結果符合度高，尤其是CTX-M9、OXA-23、MecA、OXA-66、KPC-2和ermB這6個基因按單個或按類別組合分析的符合率更佳，提示這項技術在臨床上具有良好的應用前景。

本研究所采集的樣本是高質量的下呼吸道分泌物，直接從肺部感染患者的下呼吸道吸取，避開了口腔和上呼吸道菌群的污染。樣本細菌培養陽性率為47.6%，與陳文臺等[8-9]報道的細菌培養陽性率相近。細菌培養檢出的50株致病菌株，前5位為鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌，與文獻報道的重癥監護室的細菌種類和分布相近[10]。

本研究主要檢測到5類不同的耐藥基因：①耐甲氧西林葡球菌（MRSA）的耐藥基因MecA MRSA是院感的常見病原菌，其耐藥性強[11]，MecA是MRSA的標志性基因，測出MecA就能直接明確為MRSA[12]。本研究檢測到的MecA基因與藥敏試驗的符合率為81.25%，在MRSA的感染及流行趨勢的檢測中具有良好的應用前景。②耐碳青霉烯型（β-內酰胺酶）基因OXA-23、OXA-66及KPC-2曾作為產ESBLs的腸桿菌治療首選藥物的碳青霉烯類抗菌素，其敏感性則在其越來越廣泛的使用漸漸喪失。中國CHINET細菌耐藥監測[13]報告，2013年碳青霉烯類抗菌素在腸桿菌的耐藥率為7%，較2006年的1%顯著上升。多重耐藥細菌越來越多的得到報道，治療的難度也日益增加[14]。研究測得的KPC-2、OXA-23和OXA-66是導致細菌耐碳青霉烯類耐藥的主要基因，與謝寧等[15-16]的研究結果相符。③ESBLs耐藥基因CTX-M1和CTX-M9 CTX-M型ESBLs擁有龐大家族成員，其產酶株的地域分布廣泛，菌譜眾多，作為主要基因型導致某些地區ESBLs產酶株流行或傳播[17]。CTX-M9型在我國最為多見[18]。本研究的樣本中檢測到上述3類基因的數量增加，相應的耐藥性也隨之增強，提示二者存在正相關，對臨床的抗感染治療具有重要意義。

本研究檢測到另外兩類基因為耐大環內酯類和耐氨基糖苷類耐藥基因。耐大環內酯類耐藥基因ermB的檢出率為70.9%，與宋彬容等[19-20]報道的ermB檢出率較為一致，因為紅霉素為代表的大環內酯類的抗生素耐藥性普遍較高，目前的臨床應用中有限。耐氨基糖苷類的耐藥細菌，具有多種能產生編碼乙酞轉移酶、磷酸轉移酶和腺苷轉移酶的基因[21]，本研究的芯片只包含了耐藥基因aadA1和aacC1兩種，可以解釋本類基因的總體符合率偏低（47.4%）。

綜上所述，恒溫擴增芯片法的檢出率都明顯高于傳統的細菌培養+藥敏試驗，且二者符合率較高，在臨床上具有良好的應用前景。

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（收稿日期：2019-11-22 ?本文編輯：劉克明）