透明質酸酶的研究進展

李 漫，劉建建，蘇江偉，張 燕，楊瑩瑩，吳萬福，郭學平

（華熙生物科技股份有限公司，山東 濟南 260000）

透明質酸（hyaluronic acid，HA）是一種廣泛存在于脊椎動物組織細胞外基質中的酸性黏多糖，在創傷愈合、潤滑關節、調節電解質轉運等方面發揮重要的作用。HA的相對分子質量（Mr）大小影響其生理功能。目前，HA的降解主要有物理、化學、酶降解，通過物理或化學的方法反應條件劇烈，往往會破壞單糖殘基結構，且非特異性降解糖苷鍵，而酶可特異性降解糖苷鍵，反應溫和。

透明質酸酶（hyaluronidase）是一類主要降解透明質酸的糖苷酶。隨著人們對透明質酸酶的生物學意義認識不斷深入，越來越多的證據表明，其用途非常廣泛，鑒于國內外的研究現狀，本文主要對其分類、應用、不良反應進行綜述，以期為透明質酸酶的研究提供交流。

1 透明質酸酶的分類

根據氨基酸序列的同源性及來源、最適反應pH值和透明質酸酶作用機制，透明質酸酶常被分為3類[1]。

根據目前的生產工藝及來源，分為動物睪丸來源、動物毒液、人工重組和微生物來源4大類，其中美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration， FDA）已批準上市的藥品來自于動物睪丸和人工重組，前者提取自牛、羊等動物睪丸，后者則通過將人透明質酸酶基因序列導入細胞系培養而獲得。微生物來源的透明質酸酶雖未作為藥品報批上市，但已在各類基礎研究中廣泛運用。

1.1 動物睪丸透明質酸酶

哺乳動物牛、羊睪丸是睪丸透明質酸酶的主要來源。2004年至今，FDA相繼批準了3種透明質酸酶制劑：牛型透明質酸酶、羊型透明質酸酶和重組人型透明質酸酶，適應證包括與局部麻醉藥（主要是眼科用藥）聯用以增強藥物彌散，改善麻醉效果和維持時間及輔助皮下灌注。此外，國內適應證還包含骨關節炎的治療。雖未標注用于透明質酸填充術后的不良反應治療，但其在透明質酸填充術后所致不良反應的治療中發揮了不可替代的作用。

1.2 人工重組透明質酸酶

人類基因組包含6種透明質酸酶，其中HYAL-1（HYAL，Gene of Hyaluronoglucosam inidase）、HYAL-2、HYAL-3、HYAL-4、HYAL-P1 和 PH20/SPAM1。目前關于人透明質酸酶的研究主要集中在HYAL-1、HYAL-2及PH20[2]。

動物組織提取的透明質酸酶仍存在低純度、高免疫原性等問題，限制了其癌癥治療中的研究和應用。利用基因重組技術將人透明質酸酶基因PH20整合到體外培養的細胞中，成功表達了重組人透明質酸酶rHuPH20（recombinant human hyaluronidase），純度高且降低了高免疫原性的風險。2005年12月，美國藥監局批準rHuPH20上市，適應癥是作為佐劑增加其他注射藥物的分散和吸收[3]。但當時的rHuPH20由于半衰期短，易被降解。聚乙二醇重組人透明質酸酶PEGPH20的研制成功將rHuPH20的半衰期從不到3 min，延長至10.3 h[4]。PEGPH20已于2016年上市，但國內在人工重組透明質酸酶制劑上仍為空白。2017年6月，FDA已批準rHuPH20與利妥昔單抗聯用于淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病的治療。目前，PEGPH20結合單抗藥物或其他抗腫瘤化療藥物的研究也有報道[5]。

國內對于此酶的研究也從未停滯。姜廷等[6]探究rHuPH20促皮下注射藥物的擴散能力，以臺盼藍模擬聯用藥物作為可視化示蹤劑，研究rHuPH20對皮下注射藥物擴散速率的影響以及在替代藥物靜脈輸液方面具有潛在應用價值。

1.3 微生物透明質酸酶

動物來源的透明質酸酶是有限的，微生物發酵制備透明質酸酶不受原料來源的限制。微生物來源的透明質酸酶雖暫未開發成藥品，但已應用于寡聚透明質酸和低分子透明質酸的制備及各類基礎研究中。寡聚透明質酸（Oligo-HA）是指Mr小于10×103的HA，低分子透明質酸（LMW-HA）一般指Mr在104～106，均在醫藥及化妝品領域具有良好的應用前景。

目前，市售的Oligo-HA或LMW-HA來源于化學法降解和酶解法，化學降解法反應條件劇烈，對制得的產物生物活性有一定影響；酶解法條件溫和，不對其結構造成破壞。有報道將HA分離純化后加入透明質酸酶降解，再經膜過濾、乙醇沉淀、脫水干燥等，工藝復雜且微生物來源的透明質酸酶發酵液酶活性較低，發酵液最高酶活性約l02IU/ml，較難應用于工業生產。郭學平等[7-9]發現了一種芽孢桿菌產生的透明質酸酶，發酵液酶活性可達105IU/ml，純化后可以達到106～107IU/ml。利用此酶降解HA成功制備了Oligo-HA或LMW-HA。經驗證，此法生產的Oligo-HA或LMW-HA外用時可滲入皮膚表皮層，供給皮膚營養和水分，防止皮膚老化，還能防止紫外線的傷害，修復曬傷的皮膚細胞，可用于化妝品中；口服時易于吸收，不僅可清除自由基，活化皮膚細胞，同時有良好的增強免疫功能和抗衰老功能，可用于食品和保健品中；此外，還有促血管生成、細胞免疫活化和促進骨生成的作用，對治療細菌性角膜潰瘍也有良好的療效，可用于醫藥領域。此發明還提供了一種重組制備此透明質酸酶的方法，利用此發明生產的透明質酸酶酶活性高、熱穩定性及pH穩定性高，顯著降低生產成本，目前已實現了全球首家酶切法生產Oligo-HA及LMW-HA的產業化。

近年，學者對產透明質酸酶的微生物進行了總結[10]。產透明質酸酶的菌株的研究多集中在節桿菌、巴斯德桿菌、獸疫鏈球菌、芽孢桿菌等[11-15]。為獲取編碼透明質酸酶的基因序列，解析了一系列透明質酸酶的氨基酸序列，研究相對透徹的是肺炎鏈球菌和無乳鏈球菌分泌的透明質酸酶[16-17]。有關芽孢桿菌產透明質酸酶的氨基酸序列也已被解析[7]。越來越多對細菌來源透明質酸酶的結構、機制、性質等的基礎研究，為其下一步的研究和應用提供了方向。

2 透明質酸酶的臨床應用

2.1 促進其他注射藥物吸收和分布

最初，FDA批準透明質酸酶作為佐劑提高其他注射藥物的吸收和擴散，皮下注射透明質酸酶可降解皮下的透明質酸，提高組織通透性，使皮下輸液的滲出液或局部蓄積的血液加快擴散，降低局部藥物濃度，加速外滲藥物吸收，同時可減輕注射部位疼痛。

2.2 麻醉輔助劑

透明質酸酶與局麻藥合用時，可加快麻醉的起效時間，減少局部浸潤所致的腫脹；此外，還可能促進局麻藥在體內的擴散和分布，增加局麻藥在體內的吸收，從而增加全身反應發生的幾率。

2.3 眼科方面的應用

關于透明質酸酶在眼科手術麻醉、白內障、青光眼、玻璃體視網膜疾病等方面的應用較多，總結為可減少局部麻醉藥物使用量，降低因此帶來的結膜水腫及眼壓升高的風險；可加速局麻藥物發揮效應的時間，加大麻醉劑擴散，增加手術安全性；白內障手術時，使用HA保護角膜和眼內組織，但術后常見暫時性眼壓升高，白內障術中應用透明質酸酶，可預防后發性白內障發生；在青光眼濾過術中穩定眼壓；在玻璃體視網膜手術中，探討如何引導玻璃體液化，并較完全地后脫離以增加玻璃體視網膜手術安全性和成功率的研究已成為熱點，透明質酸酶可使玻璃體液化，是輔助玻璃體切割最有應用價值的酶之一；在其他眼病，如類固醇性高眼壓及甲狀腺相關眼病中，均有積極的治療作用[18]。透明質酸酶一直是眼麻醉手術中常見的添加劑，但也有人質疑其作為麻醉輔助劑在白內障手術期間的使用的必要性，并評估了在不存在透明質酸酶情況下麻醉結果的差異，提出為規避風險，建議在白內障手術進行中不需要添加透明質酸酶[19]。

2.4 醫學整形美容并發癥中的應用

透明質酸類注射填充劑在臨床上可用于皺紋、凹陷、萎縮等，是一種理想的軟組織填充劑。但當HA填充不當，則易引起炎性肉芽腫、皮下硬結、血管栓塞致組織壞死等[20]。透明質酸酶作為特異性水解HA的藥物，在醫學整形美容方面主要用于治療注射HA術后并發癥，尤其是各類血管危象，血管危象最終導致的病理結果是微循環障礙，也就是血管栓塞。如HA一旦進入眼動脈，易造成視網膜中央動脈栓塞，眼球后注射透明質酸酶，能降解血管內及周圍組織的HA，臨床上也有成功的案例[21]。出現栓塞征兆，要第一時間合理處理，最重要在于快速診斷和即刻使用高劑量的透明質酸酶[22]。Loh等[23]在發現出現右眶下動脈阻塞和皮膚壞死跡象時，立即實施高劑量透明質酸酶脈沖用藥方案，成功阻止情況惡化，恢復了血管功能。

2.5 其他應用

透明質酸酶含量檢測有較高的靈敏度和特異性，可作為早期癌癥的診斷指標[24]；透明質酸酶可增強化療藥物的藥效，加速治療性抗體的吸收；促進胰島素吸收；作用于神經細胞，改善毛細血管通透性，促進神經功能的恢復等。王新宏等[25]探討鞘內注射透明質酸酶治療結核性腦膜炎（TBM）療效，治療組加用鞘內注射透明質酸酶治療，結果顯示治療組療效明顯優于對照組。

此外，透明質酸酶活性檢測可作為一種有效的判斷生育力的指標[26]。精子頂體內的透明質酸酶在受精過程中起重要作用，影響男性生育力。馬曉萍等[27]分析88例精液標本，透明質酸酶的活性與精子P34H蛋白表達量呈正相關性，男性不育患者精子P34H蛋白表達量減少，透明質酸酶活性減弱。與其他藥物聯合應用也多有報道，崔穩麗[28]對126例結腸炎所致的慢性盆腔疼痛患者使用透明質酸酶聯合抗生素治療，發現透明質酸酶能顯著提高抗生素對結腸炎所致盆腔疼痛的臨床療效。腫瘤疫苗一直是癌癥免疫治療研究中的熱點，將納米抗體與透明質酸酶結合，實現了體內抗腫瘤治療效率的增強，為癌癥免疫治療提供了一種簡單而有效的策略[29]。新的用途也在不斷的被發現，Gomella[30]報道了第一例將透明質酸酶用于腸造口脫垂，以幫助減少腸造口手術手動按壓失敗后缺血性和阻塞性失禁。

3 透明質酸酶的不良反應

透明質酸酶不良反應發生率較低，不同的注射部位和注射劑量導致的過敏反應不同。在對以往的透明質酸酶相關文獻回顧總結中[31]，眼周麻醉時，注射局部過敏反應發生率為0.05 %～0.69 %，主要癥狀有水腫、疼痛和瘙癢；施用高劑量透明質酸酶（200 000 IU）時，過敏性并發癥風險可升至31.3 %。Kim[32]報道了一例在矯正HA填充過量的注射部位的過敏反應，注射部位紅斑和腫脹，這種副作用有別于常見的透明質酸酶過敏反應。張元文等[33]探討透明質酸酶治療HA過度填充引起填充物積貯而導致局部出現皮下腫塊或硬結的有效性及安全性，療效滿意，無嚴重不良反應。不同生物來源的透明質酸酶，也是過敏反應發生的原因，如動物組織提取來源相較于人工重組來源，雜蛋白含量高、免疫原性強，但目前臨床上使用的產品絕大多數是動物組織來源。

為避免不良反應發生，需考慮是否進行過敏性皮試，透明質酸酶注射液的配制、注射的層次、注射量、注射針頭的選擇，避免注射炎癥感染部位，與藥物聯用的注意事項、配伍禁忌、用藥史，注射后護理等問題[20,33-34]。

4 展望

由于HA填充劑在醫療美容領域的廣泛應用，透明質酸酶在治療血管栓塞，尤其在栓塞致盲的案例中成功復明較罕見，臨床上透明質酸酶如何與多種藥物聯合使用，如何處理此類狀況仍需研究。隨著對透明質酸酶研究深入，透明質酸酶在體內參與了炎癥反應、創傷修復、毒素擴散、受精等，能特異性降解HA，因此開發酶抑制劑對于研發抗菌劑、抗腫瘤制劑、避孕藥等奠定基礎。此外，天然透明質酸酶因其體內循環半衰期短嚴重影響了藥效發揮，開發設計長效透明質酸酶也是未來研究的熱點。